westernblot详细现用图解.doc

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1、Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗

2、体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.0ml；10%SDS6.0ml；β-巯基乙醇0.2m

3、l；ddH2O2.8ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。 4. 0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。 6. 显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0μl。二、蛋白样品制备

4、 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 （2） 每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 （3）按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） （4） 每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 （

5、5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） （6）于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷） （7） 将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于－20℃保存。 2. 组织中总蛋白的提取 （1）将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 （2） 加400μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。 （3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 （4） 裂解30min后，即可用移液器将裂

6、解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： （1）将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。 （2）弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 （3）用枪洗干上清后，加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 （4）将裂解液

7、与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。 三、蛋白含量的测定 1. 制作标准曲线 （1）从－20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。 （2）取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。 （3）按下表在各管中加入各种试剂。（4） 混匀后，室温放置2min。在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。 2.