蛋白表达及纯化课件.ppt

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1、蛋白表达、纯化抗体制备应用及ELISA间接法卢士强2010-11-18Part1:蛋白表达、纯化蛋白表达流程目的基因cDNA表达宿主载体设计引物连接转化诱导表达蛋白纯化鉴定保存geneCell-freeBacterialYeastInsectMammalianHostExpressionSystemCharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoublingtimerapid(30min)rapid(90min)slow(18-24hrs)slow(

2、24hrs)costofgrowthmediumlowlowhighhighexpressionlevelhighlow–highlow–highlow–moderateproteinfoldingrefoldingmayberequiredrefoldingmayberequiredproperfoldingproperfoldingN-linkedglycos.nohighmannosesimple,nosialicacidcomplexO-linkedglycos.noyesyesyesphosphorylat

3、ionnoyesyesyesacetylationnoyesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesprojectcostlowlowmiddlehigh一：大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质

4、内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)Vector二大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：复制起点(ori)多克隆位点。筛选标记（抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记）控制和调节转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达,它的编码结构必须是连续的,不间断的,处于寄主启动子有效控制下。可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1)强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10%-30%以上2)应能呈现出一种低限的基础转录水平3)应该是诱导型的,能通过简单的方式,使用廉价的

5、诱导物得以诱导。常用的大肠杆菌表达载体启动子：λ噬菌体的PL启动子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子色氨酸操纵子trp启动子pBR322质粒的beta－内酰胺酶启动子启动子终止子a:如果在克隆基因编码区的3末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子b:如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子,那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。c:转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性,大大提高蛋白质产物水平。d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子,阻止核

6、糖体跳跃(skipping)现象。e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA,当其后连上一个U而形成四联核苷酸的情况下,转译终止效率便会得到进一步加强转译起始序列a:mRNA的5末端之独特的结构特征,是决定mRNA转译起始效率的主要因素。b:在构建外源基因的高效表达载体时,需认真选择有效的转录起始序列。c:未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构(KOZAKSEQUENCE)筛选标记:其编码产物可被快速测定的功能单元。追踪某些特定的DNA结构(重组质粒)是否已经导入寄主细胞同任何一种目的启动子连接,其表达活性可作为检

7、测启动子功能的依据。β－半乳糖苷酶基因lacZ荧光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰转移酶)基因(cat)四环素抗性基因(tetr)Tag-目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基Xgene引物的设计：设计一对特异性引物。上游、下游引物引入酶切位点oligo6RNA提取：TRNzol（附件）RT-PCR：附件1：DNAmarker；2：X基因扩增产物图1.1X基因的RT-PCR扩增产物GenecloningYourdestinationvectorR1R2Yourline

8、arizedvectorX基因R1R2+1.双酶切目的基因和载体及切胶回收：附件目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基2.连接转化：附件3.双酶切鉴定：附件4.测序：附件1：DNAmarker;2：重组质粒pET28-X双酶切;3：空质粒pET28a双酶切图1.3重组质粒pET28-X双酶切鉴定图1.4X基因发生点突变(AGU→AGC)，但为