实验二：淋巴细胞分离实验-PPT文档资料课件.ppt

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1、小鼠脾脏淋巴细胞的分离目的原理实验步骤注意事项目的熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离方法原理脾脏各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。原理外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001(PBMC)1.0921500rpm,20℃,30minPBMC红细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、血小板实验步骤1.实验一获取的小鼠脾脏载

2、玻片研磨（研磨同时滴加1640培养液，保持细胞活性）2.细胞混合液静置数分钟后吸管吸取，沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层液上方（Ficoll：血细胞=1：1）实验步骤3.2000r/min，离心15min4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移入另一试管中实验步骤5.加足量稀释液充分洗涤，1000r/min离心5min，弃上清6.适量的培养基重悬细胞，计数注意事项1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面2.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染细胞计数实验步骤注意事项实验步骤1、准备计数板：2、制备细胞悬液：

3、收集细胞，制成单个细胞悬液3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数实验步骤5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）×104注意事项1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液、计数试验报告要求原理,步骤,结果,讨论。