细胞培养原理和基本技术课件.ppt

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1、细胞培养原理和基本技术细胞全能性细胞培养是基于细胞全能性发展起来的细胞生物学技术克隆：无性繁殖植物细胞培养---转基因植物动物细胞培养---转基因动物扦插生根发芽成为植株培养植物克隆丰富了人民的生活植物克隆丰富了人民的生活转基因植物将外源目的基因转入植物的细胞、组织、器官中，获得更能满足人民生活的需要的植物。细胞、组织、器官外源目的基因克隆根、茎、叶、花、果实、种子、植株抗蚜虫小麦抗旱耐盐碱水稻；富含铁的水稻；富含β胡萝卜素水稻抗除草剂作物转基因棉花：动物角蛋白(免、羊毛)棉花，光泽好，手感好，保暖性增强。既保留了传统棉花的天然本质，又具有了免、羊毛的某些品质；彩色棉花棕、绿、黄、

2、浅蓝、粉红、浅褐等；抗虫棉转基因大豆更富营养、耐贮藏番茄；不含尼古丁烟叶、能产生药物的食品动物细胞培养技术一基本概念从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长称为原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。采用原代培养细胞进行药物测试、细胞分化等，效果较好原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时

3、比较困难。其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中原代培养物经首次传代成功后的细胞即为细胞系(cellline)从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cellstrain)二体内、外细胞的差异体内细胞：机体神经体液调节和其他类型细胞影响基因表达受到外来信号调节增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）高度特化的结构和功能体外细胞：失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减弱或停止而进化中保守的增殖活

4、动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，分化特性减弱形态和功能趋于单一一定代数后衰老死亡，或发生转化，获不死性而成为能无限传代三培养细胞的类型及其特点1.贴附型贴附于支持物表面，生长中形成汇片。大多数细胞属此型。失去在体内特有形态。成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型2.悬浮型悬浮生长，单个分散或成团。各种源自血液的细胞、骨髓、脾细胞。HEK293（左）和小鼠成纤维细胞（右）四培养细胞的生存条件培养细胞所需营养物质基本营养：与体内相同，包括糖、氨基酸、无机离子、维生素、微量元素（1640，F10，F12，DMEM等等）生长因子：动物血清（小牛血清，胎

5、牛血清）基本培养液（80～90％）血清（10～20％）抗生素：双抗（青霉素-链霉素）终浓度为每毫升100单位特殊条件：高糖、胰岛素、PHA……根据自己实验特殊需要培养环境温度：35~37℃湿度：恒湿气体：95%空气/5%CO2，N2酸碱度：pH7.2~7.4（酚红指示）渗透压：=血浆渗透压290Osm/kg支持物：玻璃、塑料、饲养层、微载体五每代贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种培养后，在培养液中呈悬浮状态。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形贴壁期：细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，游离期结束。初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分

6、钟即可贴附潜伏期：细胞贴附于支持物后，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。原代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。对数生长期指数增生期：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。此时培养液消耗大，细胞代谢旺盛。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好的和最主要的阶段。细胞冷冻和细胞转染应该在此时进行。接触抑制：随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片

7、。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期进入停滞期的细胞应该及时传代。细胞代谢活动使培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低，若继续培养，细胞易发生形态改变，甚至死亡。故应及时传代虽进行了传代，但传代过晚会影响下一