表观遗传学创新实验课件.ppt

《表观遗传学创新实验课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、表观遗传学创新实验5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化的影响庞劲松刘宝东北师范大学生物基础实验教学中心表观遗传学与DNA甲基化DNA甲基化作用DNA的甲基化及其方式DNA甲基化的生物学意义DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成DNA胞嘧啶甲基化检测检测方法：MSAP，bisulfitesequencing5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响实验目的实验材料仪器试剂实验方法5’-氮胞苷处理水稻幼苗植物基因组DNA的提取与纯化基因组DNA酶切-连接接头PCR扩增：预扩增，选择性扩增PAGE电泳预期实验结果注意事项与建议思考题参考文献表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表

2、达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。表观遗传变异包括:X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。DNA甲基化：在DNA复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。DNA甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化DAM(DNA腺嘌呤甲基转移酶)识别回文序列GATC,在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸)在DMT

3、(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化DNA甲基化作用图1胞嘧啶甲基化过程图2腺嘌呤甲基化过程DNA甲基化的生物学意义影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录图3甲基化与基因沉默参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成从头甲基化(denovomethylation)DNMT3a，DNMT3b在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。维持甲基化(maintenancemethylation)Met1，DNMT1较特

4、异地识别半甲基化状态的DNA，负责在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化状态给新合成的DNA链上加上甲基。图4两种胞嘧啶甲基化方式DNA胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：甲基化敏感扩增多态性(MSAP,MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：重亚硫酸盐测序(Bisulfitesequencing)GCmTACT重亚硫酸钠GCmTATT测序测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等MSAP

5、用途：最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段原理：利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。甲基化状态分析：在不同泳道相对应的位置上，如果MspI酶切产物有扩增带、而HpaII酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。表1甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果原始序列内切酶CCGGCC

6、mGGCmCGGHpaIICCGG不切割不切割MspICCGGCCmGG不切割MSAP流程：提取基因组DNA（注意发育时期和成长状态相同）………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……………TAGGCCACCGAACGGCCTG……MspI酶切+接头HapII酶切+接头ATCCGGTGGCTTGCCmGGACATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTGTAGGCCACCGAACGGCCTGPCRPCRPAGE电泳PAGE电泳MspI5’…CC(m)GG…3’3’…GGC(m)C…5’HpaII5’…CCGG…3’3’…GGCC…3’重亚硫酸盐测序

7、图5重亚硫酸盐测序原理5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响实验目的使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。实验材料水稻：日本晴(Oryzasativavarjaponica,nipponbare)5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平：5’氮胞苷可以与DNA甲基转