定量分析方法的方法学验证.doc

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1、定量分析方法的方法学验证 定量分析方法验证的目的是证明采用的含量测定方法适合于相应分析要求，在进行定量分析方法学研究或起草药品质量标准时，分析方法需经验证。验证内容有：线性、范围、准确度、精密度（包括重复性和重现性）、检测限、定量限和耐用性等。 一，线性线性是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度。 　　应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，制备一系列供试品的方法进行测定，至少制备五份供试样品；以测得的响应信号对被测物浓度作图，观察是否呈线性，再用最小二乘

2、法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。回归方程的相关系数 ( r ) 越接近于 1 ，表明线性关系越好。 　　用 UV 法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液，吸光度 A 一般在 0.3 ～ 0.7 ，浓度点 n ＝ 5 ，用浓度 C 对 A 作线性回归，得一直线方程，方程的截距应接近于零，相关系数 r 应大于 0.9999 。 　　用 HPLC 法测定时，以对照品配制一定浓度范围的对照品系列溶液 ， 浓度点 n ＝ 5 ～ 7 ，用浓度 C 对峰高 h 或峰

3、面积 A 或被测物与内标物的响应值之比进行线性回归或非线性拟合（如 HPLC-ELSD ），建立方程，方程的截距应趋于零，相关系数 r 应大于 0.999 。 　　线性关系的数据包括相关系数、回归方程和线性图。 二，范围　　范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 　　范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。三，精确度　　准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近

4、的程度，一般用回收率 ( ％ ) 表示。准确度应在规定的范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。 1. 测定方法的准确度 　　可用已知纯度的对照品做加样回收率测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。 在加样回率收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。 回收

5、率 % = [(C-A)/B]*100% 式中， A 为供试品所含被测成分量； B 为加入对照品量； C 为实测值。 2. 数据要求 　　在规定范围内，取同一浓度的供试品，用 6 个测定结果进行评价；或设计 3 个不同浓度，每个浓度各分别制备 3 份供试品溶液进行测定，用 9 个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在 l ∶ 1 左右，其他两个浓度分别约为供试品含量的 80% 和 120% 。应报告供试品取样量、供试品中含有量、对照品加入量、测定结果和回收率 ( ％ ) 计算

6、值，以及回收率 ( ％ ) 的相对标准偏差 (RSD) 或可信限。 四，精密度　　精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。 1. 精密度的表示方法 　　气相色谱法和高效液相色谱法是对同一供试液进行至少五次以上的测定；精密度一般用相对标准偏差 (relative standard deviation, RSD) 表示： RSD= 标准偏差 / 平均值 ′ 100 ％ 　　精密度报告的数据应包括平均值、可信限及相对标准偏差。 　　一般在一天之内进行的精密度考

7、察称为日内精密度 (inter-day variability) ；在三天之内进行的精密度考察称为日间精密度 (intra-day variability) 。 　　有时为了考察随机变动因素对精密度的影响，还需设计进行中间精密度试验，变动因素包括不同日期、不同分析人员和不同设备。 2. 重复性（ repeatability ） 　　是指在同一条件下对同一批样品，从样品供试品液制备开始，制备至少六份以上供试品溶液 ( 即 n>6), 或设计 3 个不同浓度，每个浓度各分别制备 3 份供试溶液，进行测定

8、，计算其含量的平均值和相对标准偏差 (RSD) 。 RSD 一般应根据样品含量高低、含量测定方法和繁简进行制订，如含量很低一般不大于 5 ％；如含量较高，则应从严要求。 3. 重现性（ reproducibility ） 　　是指在不同的实验室由不同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时，通过协同检验得出重现性结果，协同检验及重现性结果均应记载在起草说明中。应注意重现性试验样品本身的质量均匀性和储存运输中的环境影