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1、第18卷第4期河北医科大学学报Vol.18No.41997年7月JOURNALOFHEBEIMEDICALUNIVERSITYJul.1997·247·单细胞凝胶电泳分析(彗星实验)及应用彭宝成吴淑芬预防医学院营养与食品卫生教研室(050017)学报编辑部关键词单细胞凝胶电泳;方法;应用环境致突变物、致癌物对机体的损伤常具断片(Single2strandedbreaks,SSBs),而许多物有组织和细胞特异性,灵敏、快速检测单个细质诱导的DNA单链断片数量比双链断片高5胞的DNA损伤对于研究环境污染物的遗传毒～2000倍,中性条件检测DNA损伤明显不如性及作用机制,建
2、立生物监测方法具有重要的碱性条件下敏感。意义。单细胞凝胶电泳分析(Singlecell目前经常采用的方法是Singh等于1988gelelectrophoresisassay,SCGEA),也称彗星实年提出的碱性电泳方法〔1〕。在碱性条件下,有验(Cometassay)是近年建立和逐渐发展起来的助于DNA的变性和单链DNA断片的移行,此一种快速检测哺乳动物细胞DNA损伤的实验外碱性条件还可促使RNA降解,从而防止干方法,可适用于多种细胞,能够灵敏地检测扰,因而能够进行DNA单链损伤的检测,灵敏DNA断裂,在检测诱变剂、射线对DNA的损度大为提高。伤,监测环境污染物对机
3、体的遗传损害,研究致癌机制等方面有广泛的应用。2原理1SCGE方法的发展大的DNA分子在断裂剂作用下出现单链或双链断裂,由于DNA分子在细胞核内形成70年代末Rydberg和Johanson最早报道紧密的超螺旋结构,检测这些断裂需要将双链直接定量检测单个细胞DNA损伤,将琼脂糖DNA分子解螺旋,高pH(>12.3)促使DNA变包被于载玻片上,靶细胞包埋于琼脂糖中,裂解性和解螺旋从而有利于单链和双链DNA断片细胞,在弱碱性条件下使DNA解螺旋,中和后的移动。在电场作用下,DNA断片向阳极移以丫啶橙染色,用光度计测定绿色荧光(表明为行,移动的距离与DNA断片的分子量和电荷
4、双链DNA)与红色荧光(为单链DNA)强度,两数相关,经溴乙啶染色后,在紫外线照射下发出者比值定量反映DNA损伤程度。该法由于条荧光,使每个受损的细胞均呈现彗星的外观,明〔1〕件要求严格,未能广泛应用。亮的头部为细胞核,一系列的DNA断片组成为改进方法的敏感性,Ostling和Johanson彗尾,尾巴的长度和荧光强度与诱变剂导致的又发展了微凝胶电泳技术,细胞包埋于琼脂糖DNA断裂数成正比,未受损细胞只有不动的细凝胶中,置于显微玻片上,用高浓度的去污剂和〔3,4〕胞核(彗核)而无彗尾。盐裂解,然后在中性条件下短时间电泳,DNA断片从细胞核向阳极移行,从而形成类似于彗3
5、操作步骤星的尾巴,指向阳极,如果细胞中DNA损伤大,断片移行的距离也就长,DNA的移行可用3.1玻片制备:以无钙镁磷酸缓冲盐溶液溴乙啶染色后用显微光度计测定〔2〕。然而中(PBS)配制0.5%常温熔点琼脂糖(NMA)溶性条件下裂解和电泳只能检测双链DNA断片液,加热熔化后,冷却至45℃,取100μl滴于洁(Double2strandedbreaks,DSBs),不能测定单链净的载玻片上,立即盖上盖玻片,使琼脂糖均匀·248·河北医科大学学报第18卷第4期〔7～9〕地敷在载玻片上,置4℃下10分钟待琼脂糖冷可按常规分离方法进行,细胞活力以苔盼却变硬,为第一层,取下盖玻片
6、;以PBS将受试蓝检测。7靶细胞配成3×10个/ml细胞悬液,取1000～4.2细胞染毒:体外实验,使用原代细胞或细50000个细胞与75μl0.5%的低熔点琼脂糖胞株制成单细胞悬液,可将受试物加入生物培(LMA)溶液在37℃下混匀,迅速滴在第一层琼养基(如含10%小牛血清的WME,RPMI1640脂糖上,加上盖玻片,4℃10分钟使LMA硬化,或SMEM)、PBS或Hepes缓冲的Hanks液(含小心地取下盖玻片,在其上滴加75μl0.5%钙),在4℃或37℃下与细胞悬液作用,除在去LMA为第三层,同样加盖冷却硬化。除受试物后立即检测DNA损伤外〔4〕,也还可3.2电
7、泳:取下盖玻片,将玻片立即浸入预冷以在37℃下培养不同时间观察DNA的修复,的裂解液(2.5mol/LNaCl,100mmol/L从而研究SSBs形成和消失的规律〔7〕。Na2EDTA,10mmol/LTris,pH10,1%肌氨酸整体实验程序如下,以不同途径给动物染钠,1%TritonX2100及10%DMSO组成,临用毒,间隔一定时间后(1～72小时),取组织分离前配制)中,4℃下放置1小时,使细胞裂解并使细胞,检测细胞活力,立即进行SCGE分析,该DNA松散,过夜亦可,但时间过长裂解液可能方法已经用于呼吸道及胃肠道染毒后进行毒物出现沉淀。取出玻
