血红蛋白的提取和分离课件111资料.ppt

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1、课题3血红蛋白的提取和分离专题5DNA和蛋白质技术一、基础知识--蛋白质提取和分离原理蛋白质提取与分离的依据－－蛋白质的物理化学性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法（1）原理：（2）材料大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。(一)凝胶色谱法（3）分离过程混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。(一)凝胶色谱法(一)凝

2、胶色谱法㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：1、什么是凝胶？2、什么是凝胶色谱法？学生活动2:3、凝胶色谱法的原理是什么？4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对分子质量不同蛋白质的具体过程。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等缓冲溶液－－洗脱剂组成：配制：作用：调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。（二）、缓冲溶液1、什么是电泳？2、影响电泳迁移速度的因素有哪些？学生活动4:4、电泳分离各种分子的原理是什么？（三）、电泳3、如何消除电荷对电泳

3、迁移速度的影响？5、请描述电泳的过程？2．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。影响蛋白质分子运动速度的因素(三)电泳1.电泳的概念指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。（2）分离方法：（3

4、）分离过程：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。(三)电泳二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。（一）样品处理1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去

5、除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。样品处理粗分离纯化纯度鉴定血液组成成分1.洗涤红细胞2.释放血红蛋白3.分离血红蛋白4.透析血红蛋白二、实验操作血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是_____________。该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的___________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α

6、-肽链2条β-肽链亚铁血红素课题3血红蛋白的提取与分离返回1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤过程：血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色课题3血红蛋白的提取与分离初次离心后的结果3次洗涤后的结果返回2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸馏水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是__________________

7、__________。④充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂课题3血红蛋白的提取与分离(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂类物质烧杯课题3血红蛋白的提取与分离(3)分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最

8、上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的