分光光度计测DNA浓度教学内容.doc

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1、分光光度计测DNA浓度DNA浓度目前比较常用简单的方法是用分光光度仪测其对某一特定波长的单色光的吸光度，一般使用紫外线光源，测量波长260纳米的吸光值，然后可以查表或者在机器上直接转化成浓度读书。  原理是，不同浓度的DNA溶液对260纳米波长的紫外光的吸光度成线形关系，可以通过作标准曲线的方法计算。 使用的单位是一般是微克/微升。分光光度法测DNA浓度二、原理DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0

2、.02当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/mlssDNA浓度约为37μg/mlRNA浓度约为40μg/ml寡核苷酸浓度约为30μg/ml（底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）若样品不纯，则比值发生变化，

3、此时无法用分光光度法对核酸进行定量，可使用其他方法进行估算。三、材料、试剂及器具1、材料提取的PUC19样品、PUC19标准样品2、试剂灭菌重蒸水，TE缓冲液3、器皿石英比色皿；UV-240紫外分光光度计四、操作步骤1、UV-240紫外分光光度计开机预热10min.2、用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后，放入样品室的S池架上，关上盖板。3、设定狭缝后校零。4、将标准样品和待测样品适当稀释（DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl）后，记录编号和稀释度。5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上，关闭盖板。6、设定紫外光波长，分别测定230nm、2

4、60nm、280nm波长时的OD值。7、计算待测样品的浓度与纯度。DNA样品的浓度（μg/μl）:OD260×稀释倍数×50/1000RNA样品的浓度（μg/μl）：OD260×稀释倍数×40/1000