酪氨酸酶活性抑制实验方案.doc

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1、酪氨酸酶活性抑制实验方案1．1材料：酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠恒温仪、紫外分光光度计、离心机。1.2试剂配制1)磷酸钠缓冲液(1/15mol／L，pH=6．8)精确称取1.000g磷酸二氢钠，1.186g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500mL，4℃冰箱保存备用。2)L-酪氨酸溶液(7.5mmol/L)精确称取L_酪氨酸0.272g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。3)受

2、试液精确称取受试样品0.1g，分别溶于20mL去离子水，得到5mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL。4)阳性对照(+CK)精确称取0.1g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL。5)酪氨酸酶液的制备以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0cm3丁状，

3、于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1(W:V)的比例加入4℃预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000r/min离心10min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2h内用完。1.3检测方法总反应体系为5mL。具体设计见表l。在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为0.03l25、0.0625、0.125，0.25、0.5。实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10min。然后加入底物L-酪氨酸

4、，立即开始计时。测定反应20min时475nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。抑制率=[(A-B)/A]×l00％其中，“A”为标准对照的吸光值，“B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。表15mL试验体系设计注：用分光光度计测量吸光值时，“受试液”、“标准对照”、“阳性对照”分别以“阴性对照1”、“阴性对照2”、“阴

5、性对照3”调零。