MTT比色试验、克隆形成试验.ppt

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1、常用测定细胞增殖能力的实验方法：MTT比色试验、克隆形成试验常用测定细胞增殖能力的实验方法活细胞计数法：费时，有一定主观性MTT比色法：简便，大样本、灵敏度较高，重复性好结晶紫染色法：与MTT法类似，但步骤多克隆形成法：反映干细胞增殖能力，周期长流式细胞术：细胞周期分布，成本高同位素掺入法：3H-TdR,125I-UdR掺入DNA，反映S期细胞活性，精度最高，但有放射性ATP生物发光法：灵敏度高，与MTT法类似MTT比色试验原理MTT比色试验步骤接种:细胞密度103~105/ml,体积100~200l培养

2、:37℃、5％CO2、饱和湿度，培养24h施加干预因素：培养适当时间（1-5d）呈色:终止培养前4～6h，每孔加5mg/mlMTT20l，继续培养溶解:每孔加DMSO150l，振荡5min比色:492nm波长，测定光吸收值（A）绘制曲线：以细胞数或作用因素（如药物浓度）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制曲线MTTASSAYCellsuspension105/ml3.2×104/ml104/ml0.32ml0.1mlMedium0.68ml0.1ml0.9ml0.9ml3.2×103/ml3.2×105/m

3、l0.9ml0.1mlMTTASSAYMTTASSAY1033.2×1033.2×104104105MTT比色试验注意事项培养板：贴壁型细胞－平底培养板悬浮型细胞－U型培养板细胞密度：不同细胞须选择适当的密度MTT溶液：4℃避光保存，出现结晶时弃去；部分细胞需摸索MTT作用最佳浓度和时间残留血清和培养液会影响吸光值注意控制吸光值与细胞数之间线性范围，一般为102～105MTT比色试验应用举例药物敏感性试验生物材料细胞毒测定放射效应测定冷冻杀伤效应测定高温杀伤效应测定激光效应测定磁场效应测定补体依赖性细胞毒测

4、定克隆形成试验概念：克隆指单个细胞在体外持续分裂繁殖6代以上，其后代所组成的细胞群。光镜下，大于50个细胞，计数为1个克隆。方法：1.平皿克隆形成试验:适用于贴壁型细胞，如正常细胞或肿瘤细胞；控制细胞迁移2.软琼脂克隆形成试验:适用于肿瘤细胞、转化细胞和悬浮生长细胞；无细胞迁移；底层为0.5%琼脂，上层为0.3%琼脂(含细胞)。用途：多用于药物、放射敏感性试验。平皿克隆形成试验软琼脂克隆形成试验MTT实验实习2人为1组，每块96孔板共4人操作预先接种细胞数:103、3.2×103、104、3.2×104、1

5、05/0.2ml/孔预先常规培养预先加入MTT0.02ml,孵育6h吸出上清液，加入DMSO0.2ml,振荡5`490nm比色，手工记录吸光值绘制曲线，纵轴（A），横轴细胞数要求交实验报告，包括姓名、学号、实验名称、目的、原理、方法和结果。实验报告计入成绩MTTASSAY