感受态细胞制备及重组转化.doc

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1、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节概述在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基

2、化酶的突变体(Rˉ,Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(

3、KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时

4、，细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

5、4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养

6、基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。第二节材料、设备及试剂一、材料E.coliDH5α菌株：Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制，eppendorf管。二、设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。三、试剂1.LB固体和液体培养基。2.Amp母液。3.含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/

7、ml，摇匀后铺板。4.麦康凯培养基(MaconkeyAgar)：取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全溶解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml，然后摇匀后涂板。5.0.05mol/LCaCl2溶液：称取0.28gCaCl2(无水，分析纯)，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。6.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2：称取0.28gCaCl2(无水，分析纯)，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。第三节操作步骤一、受体菌的培养从L

8、B平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。二、感受态细胞的制备(C