噬菌体的分离与纯化.doc

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1、噬菌体的分离纯化及一步生长曲线的绘制前言噬菌体是以细菌为寄主的一类非细胞微生物。目前对于噬菌体的研究大多数集中在人和动物传染性疾病的防治方面，在环境的治理方面的研究报道较少，因此我们试图分离纯化污水中的噬菌体，掌握其生物学性质，应用所得噬菌体处理、净化生活污水，减少生活污水中病原性细菌的危害。本研究以从小鹅中提取的大肠杆菌为宿主菌，从污水中分离噬菌体并进行纯化，最后绘制一步生长曲线。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种及样品菌种：从小鹅中提取的大肠杆菌，由老师提供。污水来源：主要来自于农大出水口。1.1.2试剂1mmol/LCaCl2溶液1.1.3试剂的配制(1)液体牛肉膏培养基：胰蛋

2、白胨5g，牛肉膏1.5g，NaCl2.5g，加H2O至500mL，pH7.4，121℃20min高压灭菌。(2)3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121℃20min高压灭菌。(3)固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。(4)半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌。1.1.4主要仪器电热恒温培养箱（SHEL·LAB）、电热恒温水温箱（HHW21·Cu600，XMTD）、恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）、通风柜

3、（M·TFG-A）、医用净化工作台（苏净集团安泰公司）、台式离心机（eppendorf）、台式高速冷冻离心机（BECKMANCOULTER）、超低温冰箱（FormaScientific）、YM50全自动不锈钢立式电热蒸汽消毒器、针头式细菌过滤器、0.22μm微孔滤膜（上海市新亚净化器件厂）、微量移液器（GILSON）、UVette(Eppendorf)。1.2方法1.2.1噬菌体的分离1.2.1.1摇菌老师提供的大肠杆菌液加入5mL1×牛肉膏液体培养基，混合后，37℃振荡（120rpm）14h，此时大肠杆菌达到了对数生长期，取出4℃保存。1.2.1.2噬菌体分离从农大出水口采集未经消毒

4、处理的污水样本一瓶，经双层滤纸粗滤后取用50mL，加入氯化钙母液（终浓度为1mmol/L），再用0.22微米微孔滤膜过滤除菌。取10mL滤后液加入5mL3×牛肉膏培养液，再加入对数生长期宿主菌悬液0.5mL，混匀37℃过夜。次日8000rpm离心30min,取上清液4.5mL加5mL3×牛肉膏培养基及宿主菌液0.15mL，室温放置1h,30℃振荡（120rpm）10h,取出后再次离心（12000rpm,30min），微孔滤膜过滤，-20℃保存待用。1.2.2单层平板验证试验1.2.2.1浇板将配制的牛肉膏固体培养基浇板，注意不要被污染，放入37℃温箱培养过夜，验证有无细菌生长。1.2.

5、2.2涂板将1×牛肉膏琼脂平板分成3个扇形区，无菌吸取宿主菌液0.1mL，滴入平板，用灭菌的曲玻棒均匀涂开，超净台内自然干燥后，选一扇形区滴入过滤后噬菌体原液，用曲玻棒在该区域涂匀，不要超过界限，自然晾干后，30℃温箱培养12h,室温放置2h后观察噬菌体区域有无细菌生长。结果，单层平板噬菌斑不明显。1.2.3噬菌体双层平板噬菌斑实验1.2.3.1稀释噬菌体原液取0.2mL噬菌体原液，加入1.8mL1×牛肉膏培养液，为一倍稀释，依此类推，稀释度为101、102、103、104、105、106稀释液4℃内保存。1.2.3.2双层平板噬菌斑试验取102、104、106被稀释的噬菌体原液各0.

6、05mL与宿主菌0.15mL混匀，室温放置15分钟后，加入50℃上层牛肉膏培养基约2.5mL，将该混合液迅速倾倒入下层牛肉膏培养基平板上,摇匀平置5min,37℃温箱培养12h后观察噬菌斑形成情况。结果，第一次试验，仅宿主菌为松原猪的出现噬菌斑，其余三株均未出现结果下图为松原猪大肠杆菌为宿主菌的双层平板噬菌斑照片：图1为稀释度为102的噬菌斑图片图2为稀释度104的噬菌斑图片1.2.4单一性噬菌体筛选1.2.4.1挑噬菌斑在噬菌斑形成的双层平板上挑取形态大小一致、单个独立的典型噬菌斑，用最小的枪头穿刺目的噬菌斑，将穿刺后的枪头放入5mL3×牛肉膏液体培养基，轻轻搅拌，重复2～3次后，加

7、入噬菌体宿主菌液0.2mL，摇匀，室温放置1h,37℃培养12h,4℃下12000rpm离心30min,取上清4℃保存。1.2.4.2纯化反复用双板试验验证噬菌体，在多次试验中，均没有再出现噬菌斑。2.结论在老师所提供的八株大肠杆菌当中，只有松原猪型大肠杆菌成功的分离出噬菌体，并出现了明显的噬菌斑。但经过多次反复试验，均没能够成功纯化。，所以导致无法成功绘制噬菌体一步生长曲线。