实验三 植物冰冻切片制作及显微观察.doc

《实验三 植物冰冻切片制作及显微观察.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、实验三植物冰冻切片制作及显微观察植物冰冻切片制作及显微观察一实验原理冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法，因其不需经过脱水和透明等步骤，具冇快速、简便、易操作等特mis点，而且能比较好地保存组织的酶活性，较完好地保存组织抗原的免疫活性，是原位杂交、酶组织化学和免疫组织化学等实验中常用的方法。冰冻切片的种类较多，常用的切片机主要分为两大类：开放式冰冻切片机和恒温冰冻切片机。前者主耍包括半导体制冷切片机、醇制冷切片机及老式C02、氯乙烷等切片机等，开放式冰冻切片机由于暴露于空气中，温

2、度不易控制，技术难度大，现多已淘汰。后者主要是低温恒冷箱冰冻切片法，是目前应用最为广泛的方法。冰冻切片在动物和人体的研究中已被广泛应用，但在植物上的应用相对较少。原因是植物组织屮存在液泡结构，而且由于细胞壁的存在细胞Z间有较大间隙，细胞含水量远大于相同体积的动物细胞，更容易在低温冷冻过程中形成冰晶，损伤植物细胞的细微结构且比较容易破碎，难以切片和保持植物组织结构的完整性，也使得准备植物组织的冰冻切片存在一定的困难。因此，在植物材料进行冷冻切片时常使用冷冻保护剂进行处理。冷冻保护剂的作用就是能与组织细胞屮的水

3、分结合，降低细胞内溶液的冰点，使形成冰晶或较大冰晶的机会减小，从而减轻细胞内冰晶的损伤。常用的的冷冻保护剂有蔗糖和甘油等，不同植物组织细胞结构不同，因此选择适合的保护剂的浓度非常重要。另外，影响植物冰冻切片的主要因素还冇包埋剂和切片厚度等，冰冻切片常用的包埋剂有水、普通胶水和OCT,用水做包埋剂，较难切出完整的切片；OCT包埋剂与普通胶水效果基本相同，都能切出完整的切片，如果在冰冻前将材料浸没在OCT或胶水中，让OCT或胶水充分渗透进组织屮，切片效果更好。切片不可过厚，否则细胞重叠不易观察；切片也不可过薄，

4、否则切片容易破碎，需根据不同实验材料和实验目的进行优化。二实验材料拟南芥茎段三主耍仪器和试剂leica冰冻切片机、光学显微镜OCT、TBO、四实验方法1.取新鲜烟草茎段，切成0.5cm左右的小段2.取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。3.将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。4.调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切,纤维多细胞稀的可稍为厚切。5.调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，

5、准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一吋间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。6.在干净的载波片上滴上一滴水，用预冷的解剖针将切好的材料挑起,迅速置于载波片上的水中展片。7.吸去多余水分，用1%TB0滴染展开的切片材料5s,迅速用水洗去染料。8.用80%甘油封片。1.显微镜拍照。五冰冻切片时的注意事项：1.防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。冇吋需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果

6、有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。2.当切片吋，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口屮哈气，或者用大拇指按压组织块，以此來软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。3.用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差,当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻

7、片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片來附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。