白毒鹅膏菌漆酶的产酶条件、酶学性质及用于染料脱色的研究.pdf

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1、大学生科研论丛理论研究第一期白毒鹅膏菌漆酶的产酶条件、酶学性质及用于染料脱色的研究于涛王方忠董翠玲徐国英（海洋学院2004级本科生）指导教师：朱启忠摘要：从威海玛珈山上采集的大型真菌中筛选出漆酶高产菌株白毒鹅膏菌。对其产漆酶最适培养条件、漆酶的分离纯化、动力学性质、染料的脱色等方面进行了研究。培养与产酶条件的单因素和正交试验分析表明：麸皮20g/L，酵母膏5g/L，装液量1/5，温度25℃，培养8d时产酶活达到最高，为365u／mL。经盐析、透析、纤维素离子交换和凝胶过滤四步纯化，粗酶液被纯化了22.03倍，比活力达23

2、0.59u/mg，酶活回收率达22.02%。测定了该酶的基本酶学性质，最适pH和最适反应温度分别为4.6和20℃，在pH5.0-5.4和低于60℃时有较好的稳定性，以邻联甲苯胺为底物的表观Km值为66.7µmol/L；Ba2+、Cu2+、、SO42-离子对漆酶有激活作用，而Ag2+、Cl—、Fe3+离子则有抑制作用。研究表明白毒鹅膏菌漆酶能使7种工业染料脱色，其中直接黑G和中性黄GL在pH值5、温度30℃条件下，5U/mL的漆酶与直接黑G和中性黄GL反应的Km值分别为3.2mg/L和25.1mg/L，Vmax值分别为2.

3、70mg/L*m和3.25mg/L*min。关键词:漆酶；白毒鹅膏菌；培养条件；酶学性质；染料脱色漆酶(对苯二酚:氧气氧化还原酶，E.C.1.10.3.2)是一种多铜酶，它是蓝色氧化酶家族中的一员。[1]催化多种芳香族化合物特别是酚类的氧化，并且伴随着分子氧还原为水。现在已经在植物、真菌、昆虫和细菌中发现具有漆酶活性的多铜氧化酶，并且主要见于真菌。有关研究表明，真菌漆酶是一种胞外糖蛋白，分子量大约在60-85kDa之间。其中10-30%是碳水化合物[1][2]。在白腐菌中漆酶通常以多重基因编码的同工酶的形式产生。不同来源

4、的真菌漆酶，在分子量、对温度和pH的适应性以及耐受能力、酶反应动力学等特征方面都有一定的差异，这些差异不仅表现在异种微生物之间，以及在同种微生物的不同菌株之间，也表现在同株微生物漆酶的同工酶之间。[3][4][5]漆酶是一种能够应用于一系列不同工业反应如生物燃料电池、生物传感器、纸浆漂白、作为酶标[6][7][8]反应中的标签、具有生物修复功能、绿色有机物质的合成等，具有十分吸引人的应用前景。现在的研[9]究热点包括高产漆酶菌株的筛选和对新的漆酶的研究、酶的结构研究、阐明蛋白内电子转移和氧还原为[10][11]水的机制、

5、漆酶的电化学性质等等。在漆酶的应用研究中，漆酶的染料脱色作用尤为引人注目。据最新资料统计，我国每年印染废水排放[12]量，占总工业废水排放量的35%，己成为危害最大的难以治理的重要污染源.许多染料在厌氧的环境下会[13-14]转化为有毒物质或致癌物质。由于染料自身特殊的化学结构，往往不能有效地被凝结、臭氧、活性炭[15-16][17]等单一技术处理。生物处理法由于绿色环保、运行成本低，且可获得较高的脱色率，成为当前印染废水脱色研究的热点。目前，国内外对漆酶的研究多集中在彩绒革盖菌和毛栓菌等白腐菌漆酶，而对白毒鹅膏菌漆酶的

6、研究还未见报道。作者从玛珈山夏季常见大型真菌中筛选到一株非白腐菌漆酶高产菌株——白毒鹅膏菌（Amanitaverna(Bull.:Fr.)Pers.exVitt），本文报道了该菌产生漆酶的条件，漆酶的纯化、酶学性质及对染料的脱色作用，这对进一步开发漆酶资源具有积极意义。一、材料与方法(一)材料1、菌种:白毒鹅膏菌（Amanitaverna(Bull.:Fr.)Pers.exVitt）由作者采自威海市玛珈山上并经组织培养分离而来,经培养鉴定为白毒鹅膏菌,测定发现具有较高的漆酶产生能力。2、试剂:邻联甲苯胺（上海化学试剂总厂

7、分析纯）；其它化学试剂均为分析纯或化学纯。本文发表于《河南工业大学学报(自然科学版)》ISSN1673-2383CN41-1378/N第3期，第52-56页大学生科研论丛理论研究第一期3、仪器:722E型可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)，SL-Ⅱ数控层析冷柜。4、液体培养基:马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，KH2P043g/L，MgSO41.5g/L，VB10.01g/L，酵母膏5g/L。5、综合马铃薯固体培养基:1.1.4中的液体培养基去掉酵母膏，加入琼脂20g/L。（二）方法1、培养方法250mL三角瓶中装

8、液体培养基50mL.接入6--7日龄平板菌种3片(l0mm)130r/min.28℃.恒温振荡培养。2、粗酶液制备在培养的第8d取样.4000r/min离心15min，上清液即为粗酶液，冰箱保存备用。[18]3、酶活测定0.lmol/LpH4.6的醋酸缓冲液3.5mL，加入3.36mmo1/L的邻联甲苯胺0.5mL，