膀胱癌血清及尿液代谢组学研究

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1、第×期陈永婧等：膀胱癌血清及尿液代谢组学研究膀胱癌血清及尿液代谢组学研究陈永婧1王小华1黄真真1林琳1高瑶1朱尔一1邢金春2郑嘉欣2杭纬1*1（厦门大学化学化工学院化学系，厦门361005）2（厦门市第一医院泌尿科，厦门361005）摘　要　膀胱癌（Bladdercancer，BC）是世界十大常见的癌症之一。本文应用代谢组学研究方法，对与BC发病相关的生物标志物进行筛选，使用液相色谱-电喷雾质谱（Liquidchromatography-electrosprayionizationmassspectr

2、ometry，LC-ESI/MS）联用技术对20名膀胱患者与24名正常人的血清和尿液进行研究。多变量统计分析结果表明，膀胱癌患者和正常人聚类明显，血清和尿液中分别发现13个潜在标志物。其中，（2E，6E，8E）-二十二碳三烯-1-醇、7-（（1S，2S）-2-（庚胺）环己基）庚酸和（11E，14E，17E）-三烯-二十碳-1-醇首次在血清中发现，有潜力成为膀胱癌诊断标志物。液质联用结合多变量分析的代谢组学研究技术在膀胱癌诊断中展现出巨大潜力。关键词　液质联用；代谢组学；膀胱癌；血清；尿液1引言膀胱癌（

3、BC）是世界十大常见癌症之一。尽管对其病因学和致病危险因素已经被广泛研究，但是由于其高复发率和较大的临床复杂性，使得BC诊断和治疗更加困难[1-3]。基于BC不同阶段和临床表现，对于早期患者，其成活率高达约95%；然而对于晚期患者成活率降低到50%左右[4]。因此，早期诊断、治疗会大大提高患者的成活率。代谢组学在发现潜在生物标志物和改善膀胱癌早期诊断方面有独特的前景。它借助先进的分析仪器和统计工具对多种疾病进行标志物检测和研究，但用代谢组学方法研究膀胱癌的报道相对少见[5-7]。在膀胱癌的研究中，尿液

4、由于其特殊性，一直被作为首选的检测样品。目前，报道的潜在生物标志物大多来源于尿液[8]。血清中几乎涵盖了身体各个器官和组织的代谢物，所以应重点筛查。本文同时对膀胱癌血清和尿液两种样品进行研究，比起单一研究尿液样品，扩大了生物标志物的筛选范围。此外，反相色谱（Reversedphaseliquidchromatography，RPLC）和亲水作用色谱(Hydrophilicinteractionliquidchromatography，HILIC)联合使用将进一步增加筛选的代谢物数目及种类[9,10]。

5、2　实验部分2.1仪器与试剂乙腈、甲醇（色谱纯，Merck，USA）；甲酸（Fluka，Switzerland）；醋酸铵（Tedia，Fairfield，OH）；超纯水（18.2MΩ）；0.22μm滤膜（AgilentTechnologies，Germany）；所有标准品均购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）。所有血清和尿液样品来自20例膀胱癌患者和24例健康志愿者，由厦门市第一医院依据规范，按照合理的操作流程提供，采集后存于-80°C。分析前，所有样品在室温下解冻。样品统计详细信

6、息如表1所示。表1样品统计信息Table1Demographicdata样本特征Characteristics膀胱癌患者BCpatients正常人Healthycontrols样本数目No.ofsubjects2024年龄（平均值，范围）Age(average,range)60,45-7457,41-77男性Male1518女性Female5465第×期陈永婧等：膀胱癌血清及尿液代谢组学研究人种Race中国人Chinese中国人Chinese2.2实验方法2.2.1样品前处理150µL血清中加入事先预

7、冷的甲醇450µL，漩涡混合，沉淀蛋白；静置于-20°C，10min；4°C，12,000×g离心10min，取上清滤膜（0.22μm）过滤。200µL尿液中加入800µL超纯水，用于RPLC-MS分析。100µL尿液中加入400µL乙腈用于HILIC-MS分析，用乙腈稀释的目的在于避免产生“waterplug”效应，以减少对色谱分离的影响[11]。从处理后每一例样品中取15µL合并组成质量控制（Qualitycontrol，QC）样品。每隔五个样品分析QC和空白，以检验分析方法的重现性和色谱上样量。

8、2.2.2色谱分析方法RPLC和HILIC分析均采用Ultimate-3000高效液相色谱系统（Dionex，USA）。KinetexC18（2.1×100mm×2.6µm，Phenomenex，USA）用于反相分离。反相色谱流动相A：0.1%甲酸（v/v）溶液；流动相B：含0.1%甲酸（v/v）乙腈溶液；RPLC流速：300µL/min。亲水分离，采用XBridgeTMHILIC色谱柱（2.1×150mm×3.5µm，Waters，USA）。流动相A：