实验七 动物染色体标本的制备与观察.doc

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1、实验七动物染色体标本的制备与观察实验FI的1.初步掌握动物骨髓染色体标本制备过程，了解操作步骤的原理。2.了解常用实验动物染色体的数H及特点。实验原理染色体的分析往往是选择细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后细胞进入分裂的动物组织。在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。给动物注射一定剂量的秋水仙碱即nJ使许多处于分裂的细胞停滞于小期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即nJ得到大量可分析的染色体标本。在动物实验时，可在取材前经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般常用秋水仙素，这此方法对于动物的核型分析是非常有

2、用的。本方法简便、可靠，不需耍经休外培养和无菌操作，易于推广。因此骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。实验用品一、材料无尾两栖类蛙属或蟾赊属动物二、器材水平离心机、显微镜、刻度离心管（10ml）、注射器（1ml）、载玻片、烧杯（400ml）>量筒（100ml）、试管架、银子、剪刀、解剖刀、吸管。三、试剂1.1%朽”檬酸钠溶液:称取lg柠檬酸钠（柠檬酸三钠,Tri-sodiumcitrate,AR）溶解于100ml蒸憾水中。2.500pm/ml>100mg/ml秋水仙素溶液。3.Giemsa（姬姆萨）原液（

3、pH6.8）Giemsa染粉lg甘油（内三醇，glycerine,AR）33ml甲醇（methylalcoholA,AR）45ml将染粉倾入乳钵，加儿滴I「油，在乳钵内研磨直到无颗粒为止，此吋再将全部剩余片油倒入，放入60〜65°C保温箱屮保温2h后，加入甲醇搅拌均匀，保存于棕色瓶小备用。4.0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）Na2HPO412H2O11.81g（或Nq2HPO4・2H2O5.92g）KH2P044.5g溶解于蒸倔水中至1000mb5.1:10Giemsa磷酸缓冲液（pH6.8）：取1

4、ml姬姆萨原液用9ml0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）稀释即可。当天临时配制，一天后失效。6.甲醇7•冰醋酸8.0.4%KCI实验方法1.动物按30

5、ig/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙索，3〜4h后杀死动物.取出动物后肢的胫骨和股骨。剪去两端。2.将lnil1%柠檬酸钠用lml注射器接上5〃针头注入骨髓腔.将骨髓细胞先冲入离心管，反复冲洗直至股骨变为灰白色，取下注射器针头（或用吸管），反复吸打骨髓细胞，使细胞团块分散成单个细胞。3.视骨髓量之多寡加入事先预热至26±0.5吒的0.4%KC1溶液8ml

6、.随即将离心管置26±0.5°C水溶中低渗20-30mino4.以1000r/min离心8mino1.弃上清液，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰酯酸（3：1）固定液5ml,加固定液时注意不要冲动细胞团块。2.加完固定液后，立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定20mino如此反复固定2〜3次,每次20mino7固定的细胞经离心（1OOOr/min离心8mino）后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液。8.在干净、湿、冷（最好低温处理一下，冰片容易使细胞固定）的载玻片

7、上滴2-3滴上层细胞悬液，立即用口向同一•方向吹，使细胞染色体分散，在酒精灯上文火烘干（在空气干燥的地方可不用，室温下晾干）。9.将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1:10Giemsa磷酸盐缓冲液3-4ml,染色lOmino10.在自来水管下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸盐缓冲液，用小块纱布擦干玻片标本底面和四周，显微镜观察和分析。实验结果：在显微镜下可观察到染色体被Giemsa磷酸盐缓冲液染为紫红色。作业：绘制染色体图。