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1、干扰素的制备流程干扰素什么是干扰素?概念(interferon,IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型其区别在于个别氨基酸的差异上,早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的,产量低、价格昂贵,不能满足需要，,现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。基因工程菌的制备目的基因的分离目的基因与克隆
2、重组导入大肠杆菌K12克隆载体载体的体外重组受体菌的培养从受体菌中获取目的基因及筛选重组质粒表达载体导入大肠杆菌受体菌的筛选（表达性、稳定性等检测）工程菌目的基因的分离与获得重组体引入宿主细胞提取重组质粒质粒DNA的纯化目的基因与克隆载体进行体外重组从大肠杆菌K12获取目的基因对重组质粒的检测与目的基因提取目的基因与表达载体的组合与导入工艺流程目的基因的分离与获得设计合成干扰素基因的两端引物(完全的),每条引物内或5‘-端最好有内切酶酶切位点。1有药物诱导细胞,如佛波酯,使细胞表达干扰素升高。2破碎细胞,
3、提取细胞总mRNA.345用逆转录试剂盒逆转录,把总mRNA逆转录成cDNA以cDNA为模板、干扰素引物为引物,PCR,得到完全的干扰素基因的PCR产物目的基因与克隆载体进行体外重组1.提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切,用连接酶连接2.连接完成后分离纯化,测序,与原干扰素序列比对。3.鉴定序列无误后(无义突变也行),导入受体细胞,筛选重组体引入宿主细胞将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中,转化到大肠杆菌,重组的载体DNA分子在一定条件
4、下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。从大肠杆菌K12获取目的基因由于质粒重组时有3种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突变情况流程:步骤一:将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养,就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落。步骤二:步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等,在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上,不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌
5、落。原因:因为PBR322含有抗四环素基因,重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中,使其结构破坏,失去抗四环素作用。。提取重组质粒①1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养15h。培养时间:前人实验证实大肠杆菌K12生长前6h为迟缓期,6~15.5h为对数增时期,15.5~19.5h为稳定期,19.5h后为衰亡期。氯霉素:氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成,结果阻止了细菌染色体的复制,然而,松弛型质粒仍可继续复制。2、细菌的收获和裂解1）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟,弃上
6、清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(Ph8.0)1mmol/LEDTA(Ph8.0)按步骤1）所述方法离心，以收集细菌细胞。3、碱裂解法1）将洗过的500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3]重悬于10ml(18ml)溶液Ⅰ中。溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl(Ph8.0)10mmol/LEDTA(Ph8.0)溶液Ⅰ可分批配制，在101bf/in2(6
7、.895x104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，贮存于4℃。2）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/LTris.Cl(Ph8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。3）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ：0.2molLNaOH(临用前用10molL贮存液现用现稀释)1%SDS盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。提取重组质粒②提取重组质粒③4）加15ml(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾6
8、0ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配制的的溶液对钾是3mol/L,对乙酸跟是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。5）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后
