虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析-论文.pdf

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1、第29卷第4期大连海洋大学学报V01．29No．42014年8月JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYAug．2014DOI：10．3969／J．ISSN．2095—1388．2014．04．002文章编号：2095-1388(2014)04—0329—07虾夷马粪海胆TLR基因cDNA克隆及表达分析王轶南，于卓，刘洋，刘学伟，王姣姣，常亚青(大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023)摘要：采用同源克隆和eDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得一条虾夷马粪海胆Strongylocentrotusin-termediusTL

2、R基因的全长eDNA序列SiTLR一1(GenBank：HQ259110)，并采用实时定量PCR技术分析了其在组织中的分布以及在致病弧菌V／br／ofort~、[3-D葡聚糖和dsRNA刺激后的表达情况。结果表明：SiTLR一1全长序列为3637bp，形成16个0【螺旋、33个B折叠；SiTLR一1蛋白有两个跨膜区段，在725～750位有跨膜区，发现1个信号肽(1～32aa)、1个亮氨酸重复富集区(ERR)；SiTLR一1在检测的各组织中均有表达，在体腔液中表达量显著高于围口膜、管足和齿间肌(P<0．05)；经fort／s、3-D一葡聚糖刺激后，体腔液中的SiTLR-1表

3、达量显著上升，刺激后12h达到最高值；经dsRNA刺激后，体腔液中的SiTLR一1表达变化较小，仅在3h时略有升高。研究表明，TLR基因参与虾夷马粪海胆的免疫应答，克隆获得的SiTLR一1可特异性识别细菌和B—D～葡聚糖。关键词：虾夷马粪海胆；TLR；RACE；定量PCR中图分类号：$917文献标志码：ATLR是一类重要的模式识别受体(patternrec—及以北沿海，在俄罗斯远东地区也有分布，大连海ognitionreceptor，PRR)，其通过识别病原相关模洋大学于1989年将其从日本引进中国[93。本研究式分子，激活先天免疫系统产生炎症因子、抗微生中，对虾夷马粪海

4、胆TLR基因的克隆及其组织表物肽等，以抵御人侵病原，同时作为预警信号，向达情况进行了研究，以期为相关研究提供参考。抗原呈递细胞发出警报，从而启动获得性免疫系1材料与方法统。TLR识别的信号反应主要通过胞内接头蛋白髓样分化因子88介导，而后NF·Kb被激活，引起1．1材料机体的天然免疫应答，启动适应性免疫应答，导致试验用2龄虾夷马粪海胆取自大连海洋大学农各种不同炎性细胞因子分泌，从而在多种生物对微业部北方海水增养殖重点实验室，处理前于16～生物感染的监测和免疫应答的诱导中起着必不可少l8c【=海水中暂养7d。的作用¨。近年来，对水产动物TLR的研究正逐M—MLV反转录酶、E

5、XTaqDNA聚合酶、步开展，先后获得了河豚Fugurub@、牙鲆pMD19一TVector均购自宝生物(大连)有限公Paralichthysolivaceus、凡纳滨对虾Litopenaeus司，PCR引物由该公司合成。DEPC、氨苄青霉素、vannamei4J、栉孔扇贝Chlamysrre和刺参钠盐、IPTG、X—GAL、Tryptone、YeastExtract均购Apostichopusjaponicus等的TLR基因。海胆属棘皮自于上海生工生物工程有限公司。动物门，在系统进化中占据特殊位置，有关海胆的1．2方法免疫学研究越来越受到重视。对紫球海胆Strongy—

6、Iocentrotuspurpuratus的测序研究发现，其存在大量1．2．1cDNA第一条链的合成抽取5枚健康海免疫受体基因，包括TLR_8基因家族等，但有关胆活体的体腔液混合，按照RNAprepPureTissue其他海胆TLR的研究较少。虾夷马粪海胆Kit总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限S．intermedius又称中间球海胆，原产于日本北海道公司]方法提取虾夷马粪海胆体腔液总RNA。采用收稿日期：2013—11一O1基金项目：国家“863”计划重大项目(2012AA10A412)；辽宁省教育厅项目(L2012263)；辽宁省科技计划项目(2007203

7、004)作者简介：王轶南(198O一)，女，博士，助理研究员。E-mail：E-mail：wangyinan@dlou．edu．ell通信作者：常亚青(1967一)，男，教授，博士生导师。E-mail：yqchang@dlou．edu．CFI330大连海洋大学学报第29卷紫外分光光度计与1OL琼脂糖凝胶电泳检测GAL(4Ixg／mL)的LB培养基上培养，挑取阳性克RNA的浓度及完整性，于一80℃下保存备用。隆送宝生物(大连)有限公司测序。将所得序列在0．2mL的PCR管中加人100ng总RNA、1用BlastX软件进行同源性分