核酸探针技术 - 副本

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1、核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。(一)核酸探针的种类1.按来源及性质划分　可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA

2、后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用2.按标记物划分　有放射性标记探针和非放射性标记探针

3、两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、

4、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。(二)核酸探针的标记1.放射性同位素标记法　常将放射性同位素如32P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。切口平移法(nicktranslation)是利用大肠杆菌DNA聚合酶I(E.coliDNApolymeraseI)的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下：(1)取1?gDNA

5、溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液(0.5mol/LTris－HCl，PH7.2；0.1mol/LMgSO4；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白)，加入除标记物(如?-32p-dATP)外的其它三种dNTP(如dCTP，dGTP，dTTP)溶液，20mmol/L溶液各1?l。(2)加入100?ci(10?l)标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l,混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l(约5单位)E.coliDNApolymeraseI，混匀。(3)置14-16℃反应1-2小时。2.非放射性标记法　可将生物

6、素、地高辛连接在dNTP上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。其中，生物素的光化学标记法较为常用。其原理是利用能被可见光激活的生物素衍生物-光敏生物素(photobiotin)，光敏生物素与核酸探针混合后，在强的可见光照射下，可与核酸共价相连，形成生物素标记的核酸探针。可适用于单、双链DNA及RNA的标记，探针可在-20℃下保存8-10个月以上。具体操作方法如下：(1)将双链DNA变性或用NaOH处理形成缺口，单链DNA或RNA毋需处理，将核酸样品溶于水。(2)暗室下在微量离心管中加入10?gDNA

7、，1mg/ml光敏生物素20?l，加水至50?l，混匀。(3)冰浴中打开离心管盖，在300-500瓦灯下照射10分钟(液面距灯泡10cm)。(4)加入100?l0.1mol/LTris－HCl，pH8.0，加入100?l2-丁醇抽提两次，离心，弃上层。(5)乙醇沉淀核酸探针；用70％乙醇漂洗真空抽干，备用。除上述标记法外，探针的制备和标记还可通过PCR反应直接完成。(三)核酸杂交　杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合