化学发光分析法课件.ppt

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1、化学发光分析法基本原理常用的化学发光物质仪器装置影响化学发光的因素定性定量分析化学发光（chemiluminescence）：又称为冷光，它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下由化学反应而产生的光辐射。由于不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。具有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方便，易于实现自动化，分析快等特点。在生物工程学，药物学，分子生物学，临床和环境化学等各个领域正显示出它蓬勃的生机。一、基本原理化学发光反应：顾名思义，伴随着光辐射发生的化学反应，成为化学发光反应。化学发光剂：在不同的化学反应中，可以和多种不同的组分反应并发生

2、能量交换，生成激发态产物并产生发光现象的试剂常被成为化学发光剂。它们可以是氧化剂、还原剂、某些能生成自由基的物质。化学发光反应机制在化学反应过程中，某些反应产物由于吸收了反应产生的化学能，由基态跃迁至较高电子激发态中各个不同能级，然后经过振动弛豫或内转换到达第一电子激发态的最低能级，由此以辐射的形式放出能量跃回到基态。在个别情况下，它可以通过系间跃迁到达亚稳的三重态，然后再回到基态的各个振动能级，并产生光辐射，这两种光都是化学发光。A+B=C+D*（激发态分子）D*→D+h（激发态分子D*的光辐射）化学发光反应的条件能快速地释放出足够的能量。能产生化学发光的物质大多为有机化合物，

3、芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当，E=170～300kJ/mol；发光位于可见光区；处于激发状态的分子或原子必须能够放出光子，或者能够转移它的能量到另一个分子上而使此分子被激发。2.化学发光效率和发光强度化学发光效率：化学效率：发光效率：化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本身；而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。发光强度化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度Icl与该时刻的分析物浓度

4、c成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内的发光总强度来进行定量分析。二、常见的化学发光剂和化学发光体系鲁米诺过氧化草酸酯酸性高锰酸钾四价铈吖啶酯化合物鲁米诺早在1853年就被合成出来了。1928年，化学家首次发现这种化合物有一个奇妙的特性，它被氧化时能发出蓝光。刑侦学应用在检验血痕时，鲁米诺与血红素（hemoglobin，血红蛋白中负责运输氧的一种蛋白质）发生反应，显出蓝绿色的荧光。这种检测方法极为灵敏，能检测只有百万分之一含量的血。简介鲁米诺(luminol)（又名发光氨）化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼。常温下是一种黄色晶体或者米黄

5、色粉末，是一种比较稳定的人工合成的有机化合物化学式为C8H7N3O2溶液显强酸性，对眼睛、皮肤、呼吸道有一定刺激作用。鲁米诺发光原理合成3-硝基邻苯二甲酸+肼H2O+3-硝基邻苯二甲酰肼保险粉(强还原剂）3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)高沸点溶剂（如二甘醇）缩合反应还原发光体系鲁米诺-H2O2体系鲁米诺-KIO4体系鲁米诺-H2O2的反应是自身化学发光反应在PH=11的水溶液中发光效率最大鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（Dianion），它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转

6、化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分应用直接作用：增敏和抑制作用过渡金属：Cu2+,Cr3+,Ni2+,Co2+,Fe2+维生素B6，维生素B12，维生素C，吗啡，可待因，肾上腺素，多巴胺，细胞色素间接作用如Fe2+对鲁米诺-H2O2体系有催化增敏作用，而蛋白质却抑制此作用，据此可建立检测血清中蛋白质含量的方法。酶在体系中加入辣根过氧化物酶等，利用其对底物的酶解并生成H2O2的反应，可测定酶含量、底物含量或H2O2含量。鲁米诺-KIO4体系催化作用如Co2+,Mn2+,维生素C1)利用该体系可测定样品中这些组分2)利用Mn2+对该体系的催化作用来测定水中的IO

7、4-在PH=12~13的水溶液中，体系发光效率最大在免疫分析中的应用将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原或抗体上免疫反应复合物上的酶作用于发光底物目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析