氟甲喹单克隆抗体制备、鉴定及间接竞争酶联免疫吸附分析法.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第3期2010年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry313～317DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．00313氟甲喹单克隆抗体制备、鉴定及间接竞争酶联免疫吸附分析法王宇沈玉栋徐振林雷红涛王弘孙远明(广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品学院，广州510642)摘要以氟甲喹(FLU)为原料，合成4个碳原子手臂的半抗原(FLUABA)，采用活泼酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原，通过免疫Balb／c小鼠及细胞融合，获得1株

2、稳定分泌抗氟甲喹单克隆抗体的杂交瘤细胞株DB6一E7，其抗体亚类为IgG，亲和力常数(KA)为8．19×10L／tool。将氟甲喹、FLUABA及6个碳原子手臂的半抗原FLUACA分别与卵清白蛋白(OVA)偶联作为包被抗原，研究异源包被对间接竞争ELISA灵敏度的影响。结果表明，异源包被可显著提高ELISA方法的灵敏度。基于最佳异源包被(FLU—OVA)的酶联免疫吸附分析法的Ic。为26．33L，检出限为4L，定量检测范围为8．0～114tLg／L(IC～IC80)。与喹诺酮类药物及结构类似物几乎不存在交叉反应，特异性高。此方法可满足畜禽产品

3、中氟甲喹残留的快速筛查。关键词氟甲喹；单克隆抗体；异源包被；酶联免疫吸附分析法1引言氟甲喹(Flumequine，FLU)，是喹诺酮类产品的第二代抗菌剂，也是一种广谱型动物专用抗生素，杀菌活力强，对动物细菌性疾病有很好预防与治疗效果¨J。近年来，氟甲喹广泛应用于鱼类和禽类的养殖业j。然而，氟甲喹具有一定的毒性、致啼I生，对人体健康与生态平衡造成潜在威胁J。韩国食品药品安全厅公告，合成杀菌剂氟甲喹的法律允许标准值为50。欧盟、日本等均制定其最高残留限量为100Ixg／kg。我国规定氟甲喹在牛、羊、猪、鸡组织中的最高残留限量肌肉和脂肪为50，肝脏

4、为100IXg／kg，肾脏为300g／kg，鲑鱼的肉和皮为150g／kg。目前，动物组织中氟甲喹残留的检测方法有紫外分光光度法J、气相色谱法与高效液相色谱法J。紫外分光光度法检测简单方便，但其灵敏度与检出限(1～25mg／L)不能满足国家或行业要求。气相色谱法与液相色谱法虽灵敏度和准确度均较好，但前处理繁琐，操作复杂，检测成本高，难以满足现场、大批量样品的快速检测要求。近年来，免疫检测方法以其特异性强、快速、灵敏等优点，弥补了上述方法的不足，成为农产品安全检测领域研究的热点J，其中酶联免疫吸附分析法(ELISA)研究应用最为广泛。目前对于氟甲

5、喹的免疫检测研究仅有少数报道，Coillie等¨。。利用氟甲喹与离子化的BSA(OVA)合成人工抗原，制备鸡多克隆抗体，其IC如为90g／L，检出限12．5L。Haasnoot等利用氟甲喹直接偶联载体制备兔多克隆抗体，其检测范围为15～800g／L。但是，多克隆抗体存在制备周期长、抗体性能批问差异大等固有局限，不利于开发性能稳定的快速检测产品。单克隆抗体作为第二代抗体，弥补了多克隆抗体的不足。本研究合成了具有不同碳链间隔臂的新颖半抗原，制备高特异性单克隆抗体，采用异源抗原固相包被以减弱包被抗原与抗体的亲和力，提高检测药物的竞争识别灵敏度，建立

6、氟甲喹间接竞争ELISA检测方法，为进一步开发快速、简便的氟甲喹ELISA检测产品奠定基础。2实验部分2．1仪器与试剂JB一3型定时叵温磁力搅拌器(上海雷磁仪器厂)；3010紫外可见分光光度计(日本日立公司)；二氧化碳培养箱(美国SHELLLAB)；XSB1A倒置显微镜(上海精密仪器有限公司)；WellwashMK．2洗板2009-08-08收稿；2009—11-27接受本文系国家自然科学基金(No．30901005)，国家863计划(No．2007AAIOZ437)，广东省科技计划项目(No．2009A020101004)，广东省自然科学基

7、金(No．06300421)项目资助$E—mail：shenyudong@scan．edu．cn314分析化学第38卷机、MK．3酶联免疫检测仪(美国Thermo公司)；LC—MSQDECA液相色谱-质谱联用仪(Finnigan公司)；DRX~00核磁共振仪(Bruker公司)；6K．15高速冷冻离心机(Sigma-Satorius公司)。氟甲喹、左氟沙星、加替沙星、氧氟沙星、环丙沙星(华南农业大学兽药厂)；牛血清蛋白(BSA，Mw67000)、卵清白蛋白(OVA，Mw42700)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)、弗

8、氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG4000、抗体类型及亚类鉴定试剂盒(Sigma公司)；HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；RPMI一16