his融合蛋白纯化中常见问题解答集锦

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1、His融合蛋白纯化中常见问题解答集锦摘要:His-tag是专门设计用于重组蛋白质的纯化,与其他标签相比有很多明显优势,是目前用于纯化的融合标签中使用最为广泛的一种。Tag虽然简单,但是做过的人都知道,融合蛋白的纯化并非简单。纯化介质有10多种,应该如何选择?洗脱的标签蛋白杂带较多是什么原因?如何优化?甚至洗脱产物中没有目标蛋白原因为何?策略如何?GE蛋白质纯化专家就His-Tag融合蛋白在纯化过程中常常遇到的问题进行解答,不容错过!纯化的组分中没有His标签的蛋白?   经常我们的客户反馈没有纯化到His标签蛋白,不要着急,我们——来排除可

2、能的原因,首先确定是蛋白没有挂上柱子都流穿了,还是蛋白没有被洗脱下来,然后——检查原因:若His标签蛋白没有结合上去都流穿了,请依次检查:·可能原因:超声的功率不对(太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放)策略:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶 ·可能原因:样品或者是结合缓冲液不正确:策略:检测pH及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。 ·可能原因:组氨酸的标签没有完全的暴露策略:在变性条件下(用4-8M脲,或4-6M盐酸胍)进行纯化。 ·可能原因:HIS标签丢失,策略1:WB或者anti-his

3、的抗体检查His是否表达,上游构建,改变his-tag的位置(C-terminalorN-terminal),必要时增加his个数(常用6-10个)。策略2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间。策略3:改变螯合的金属离子,寻找到最佳的结合金属离子。   Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6标记的重组蛋白质的首选金属离子,也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。可

4、以利用HitrapIMACHP来筛选不同的金属离子,具体应用实例请参考《RecombinantProteinPurificationHandbook》。若没有洗脱下来,请依次检查:·可能原因:洗脱条件太温和(组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强)策略:用增加咪唑的梯度洗脱或降低pH来找出最佳的洗脱条件。 ·可能原因:降低PH的方法洗脱的,因为若pH低于3.5,会导致镍离子脱落策略:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱 ·可能原因:蛋白已沉淀在柱上策略:减少上样量,或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变NaCl的

5、浓度,或在变性条件(去折叠)下洗脱(用4-8M脲,或4-6M盐酸胍)。 ·可能原因:非特异性疏水或其他相互反应策略:加非离子去污剂到洗脱缓冲液(如,2%TritonX-100)或增加NaCl的浓度。 HIS标签蛋白洗脱后杂带较多,什么原因?如何优化?   高纯度的蛋白是纯化工作者的追求,但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS,所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带,可能的原因和优化的方法如下:·可能原因:蛋白酶部分降解了标签蛋白,策略:请添加蛋白酶抑制剂,(慎用EDTA)。 ·可能原因:杂质对镍离子有更高的亲和性策略1:咪唑浓度必须优化

6、,以确保高纯度(宿主细胞蛋白质的低结合)和高产率(组氨酸标记的目标蛋白质的强结合)之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度;在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑;咪唑的梯度不大(20个或更多的柱床体积),可能分离出有相似结合强度的蛋白。策略2:筛选最适合的缓冲液条件,NaCl浓度,pH的范围都需要进行筛选以下是(His)6-NuRR1蛋白在HisMultiTrapFF96孔板上进行缓冲液条件的筛选以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时,将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成96个不同的混合配方。实

7、验结果显示对于该目标蛋白25mMTris,10mMNaCl,10%甘油,pH8.5的缓冲液适最佳的结合条件。策略3:若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白,需要考虑多步纯化的思路,离子交换(HiTrapQHPorHiTrapSPHP)和凝胶过滤(Superdex™Peptide,Superdex75orSuperdex200)是必须的.以下是用ÄKTAxpress仪器进行四步纯化的实例。AC(亲和),DS(脱盐),IEX(离子交换),GF(凝胶过滤)所有的步骤都在ÄKTAxpress上自动执行,包括柱上的标签酶切。(参见下面图片3)文章出处《R

8、ecombinantProteinPurificationHandbook》 ·可能原因:杂质和标签蛋白结合在一起策略:在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂;增加去垢剂的浓度,

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