免疫标记技术课件

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1、免疫标记技术Immunolabelingtechnique用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体或抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术免疫标记技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性免疫标记技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术酶荧光素同位素免疫荧光法(ImmunofluorescenceTechnique)用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标

2、本中的抗原作鉴定和定位。常用荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC），显黄绿色。藻红蛋白（PE），显红色。酶免疫测定（EnzymeImmunoassay,EIA）用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。其检测的敏感度可达pg-ng/ml水平。Ab+EAbEAg+AbEAgAbE+底物（无色）呈色反应酶分解底物常用酶及其底物常用底物：邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性,但水溶性差。常用底物：对硝基苯磷酸酯(p-NPP)

3、：产物为黄色。AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、价高，故应用不如HRP普及。1.辣根过氧化物酶(HRP)2.碱性磷酸酶(AP)基本特点：①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；②酶促反应专一性，保证特异性；③底物反应放大作用，提高敏感性；④酶标试剂保存稳定；⑤操作简便，安全易行。常用方法:酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除.用于可溶性抗原或抗体的检测。*间接法：用于检测抗

4、体washwashwash*双抗体夹心法：用于检测抗原放射免疫测定法（RIA）利用放射性核素的测量方法与免疫反应的基本原理相结合的一种放射性核素体外检测法。该法有灵敏度高（可达pg水平）、特异性强、精确度佳及样品用量少等优点。常用于微量物质的检测，如激素、IgE等。常用放射性核素：3H、14C、32P—液体闪烁计数器125I、131I、51Cr、60Co---γ计数器1.ELISA检测HBsAg(小组做)实验内容3.免疫标记技术(录像)2.尿液HCG检测(胶体金法)(小组做)实验目的1.掌握酶联免疫吸附实验的基本原理；2.了解利用双抗体夹心法测定HBsAg的方法。

5、3.了解胶体金法检测HCG的原理、方法。实验材料1.HBV诊断试剂盒；2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。一、双抗体夹心法检测HBsAg实验材料1.HBV诊断试剂盒；2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。HBV感染后的血清学指标:HBsAg,HBsAbHBeAg,HBeAbHBcAb(IgG,IgM)乙肝表面抗原,存在于HBV感染的急性期及慢性期的血清中,为感染指标。实验步骤2.在各孔内加入酶标抗体1滴,37℃温育30分钟。3.各孔分别加入洗涤液(加满)---甩掉，反复3次，然后在吸水纸上吸干(倒扣在吸水纸上)。4.各孔内加入底物液A、B各1滴，

6、轻轻摇动混匀，室温避光反应15分钟。5.各孔内加入终止液1滴，观察结果。1.将已包被的孔编号，分别加入阳性对照血清、阴性对照血清及待测血清各1滴。结果判定2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性；3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；注意事项2.洗涤必须彻底，防止产生假阳性。1.加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成。二、胶体金法检测尿液HCG人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin,HCG)受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育过程中，胎盘

7、合体滋养层细胞产生大量的HCG，是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素,可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。临床上常用抗HCG检测尿液中的HCG以辅助早孕诊断和其他临床相关疾病。胶体金标记免疫技术(金标法)胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)；胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体金颗粒呈现酒红色。胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。AGTB层析流方向HCG金标试纸A：加待检尿液G：金标鼠抗人HCG单抗T：鼠抗人HCG单抗C：羊抗鼠IgG抗体B：吸水纸滴加标本CAGTB层析流方向HC

8、G金标试纸