考马斯亮蓝法测蛋白质含量课件.ppt

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1、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原理与方法。⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。一、实验目的。★考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕红色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。★在595nm下测定的吸光度值，与蛋白质浓度成正比实验原理⒈器材。可见分光光度计、试管、试管架、刻度移液管、移液枪⒉试剂。⑴水⑵考马斯亮蓝试剂称取考马斯亮蓝G250100㎎，加95％乙醇100

2、ml，溶解后加85％H３ＰＯ４，100ml，加水稀释至1000ml，存于棕色瓶。⑶蛋白质标准溶液准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置1mg/ml标准溶液。三、实验器材与试剂四、实验步骤㈠标准曲线的制作取试管6只，按下表进行编号并加入试剂，充分摇匀。123456V（标准蛋白溶液）／µl020406080100V(水）／µl100806040200Ρ(蛋白质含量）／（µg／0.1ml)020406080100试管编号试剂每支试管加入5ml考马斯亮蓝试剂振荡混合后放置5分钟于595nm测定吸光度A595为纵坐标、标准蛋白

3、含量横坐标绘制标准曲线㈡样品提取液中蛋白质含量的测定取3支试管，各吸未知浓度蛋白液0.1ml，分别加考马斯亮蓝试剂5ml振荡混合放置5分钟以制作标准曲线的1号试管做空白对照，595nm测吸光度据所测A595值，于标准曲线上查出相当标准蛋白的量，取三重复样品蛋白含量均值㈢结果计算样品蛋白质含量ug/ml五、注意事项⒈待测液中蛋白质浓度不可过高或过低，应控制在100~800µg／ml为宜。⒉比色测定时，考马斯亮蓝易吸附在比色皿表面，对后续测定造成影响，因此测定结束后用无水乙醇清洗比色皿。