蛋白质分离技术课件.ppt

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1、蛋白质分离技术(一)2021/9/151一实验目的蛋白质的分离技术；掌握凝胶过滤技术的原理及应用,凝胶的分类;商品名;型号;吸水值;掌握凝胶过滤技术分离分血红蛋白与鱼精蛋白的操作过程,装柱,上样,洗脱,Hb的制备;掌握盐析的概念,分离蛋白质的基本原理；掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术．2021/9/152BiochemistryExperiments二实验项目蛋白质的盐析与透析凝胶过滤法分离Hb与核黄素(B2)2021/9/153BiochemistryExperiments（一）蛋白质的盐析与透析盐析实验原理:在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。蛋白质溶液为亲水溶胶体

2、系，其稳定因素：水化膜和电荷。中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即形成沉淀。2021/9/154BiochemistryExperiments蛋白质的盐析与透析-原理2021/9/155BiochemistryExperiments蛋白质的盐析与透析-原理不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。2021/9/156BiochemistryExperimen

3、ts2021/9/157BiochemistryExperiments蛋白质的盐析与透析-原理盐析实验原理:蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜，而小分子物质（无机盐、单糖等）可以自由通过透析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液中。在实验室分离纯化蛋白质的过程中，常利用透析的方法除去蛋白质溶液中的小分子物质。2021/9/158BiochemistryExperiments按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留分子量。2021/9/159BiochemistryExperiments蛋白质的盐析与透析-实验操作盐析血清1ml逐渐加入饱和(NH4)2SO4溶液１1ml，边加边搅拌。

4、离心３０００rpm10分钟上清沉淀（球蛋白）逐渐加入固体(NH4)2SO4１％HCl1-2滴离心５分钟沉淀（清蛋白）2021/9/1510BiochemistryExperiments蛋白质的盐析与透析-实验操作透析１．制备透析袋２．装样：取透析袋，将一端固定，由开口端加入含有硫酸铵的蛋白沉淀。３．透析：取10倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品的透析袋悬于大烧杯中部。更换洗脱溶液数次（约30min一次），至达到透析平衡为止。４．检查：（按教材步骤操作）检查洗出液中是否有NH4＋；２支试管蛋白检测：３支试管2021/9/1511BiochemistryExperiments（二）凝胶过滤法

5、分离血红蛋白与鱼精蛋白层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。2021/9/1512BiochemistryExperiments1.层析技术分类名称操作方式固定相流动相分离

6、依据分配层析纸层析薄层层析液体液体溶解度离子交换层析离子交换柱层析固体液体带电性静电引力吸附层析吸附薄层层析气体吸附层析固体固体液体气体吸附力亲和层析酶与底物抗原与抗体固体液体配体专一性凝胶层析凝胶过滤固体液体分子大小2021/9/1513BiochemistryExperiments常用的层析原理-分配层析原理：溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。固定相内溶质的浓度流动相内溶质的浓度固定相：滤纸上吸附的水流动相：有机溶剂α=2021/9/1514BiochemistryExperiments常用的层析原理-离子交换层析原理：离子交换层

7、析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。2021/9/1515BiochemistryExperiments常用的层析原理-离子交换层析低盐浓度洗脱液高盐浓度洗脱液各试管进行连续收集混合蛋白质++++++++++++++++离子交换层析分离蛋白质示意图2021/9/1516BiochemistryExperiments离子交换层析分离蛋白