血凝血抑实验原理.pdf

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1、血凝血抑试验原理Master_2010_01_05.ppt1血凝血抑试验的重要性§是WHO对与动物流感检测的标准方法1.有效预防动物疫病的发生2.有效判断动物疫情发生的原因3.有效推动动物免疫程序的制定Master_2010_01_05.ppt2血凝血抑试验定义及原理§血凝试验（HA）定义：某些病毒或病毒的血凝素，能选择性的使某种或几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（Hemagglutination,HA），也称为直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验（HA）§血凝抑制试验（HI）定义：当病毒的悬液中先加入特异性

2、抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HemagglutinationInhibition，HI）反应，也称为血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血抑试验（HI）。§原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。§目的：检测鸡群是否有病毒感染和监测鸡群的免疫状态。Master_2010_01_05.ppt3血凝血抑试验定义及原理§用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定：根据抗原与相应抗体的特异

3、性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒做HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。§解析：如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。Master_2010_01_05.ppt4血

4、凝血抑试验具体步骤1.PBS液配置（举例，各实验室可能方法不同）：称取NaCl24g，Na2HPO48.7g，KCl0.6g，KH2PO40.6g，加蒸馏水至3000ml，加热溶解后调pH值至7.2，121度高压灭菌15min，4摄氏度保存备用2.1%鸡红细胞液制备（举例，各实验室可能方法不同）：I.采血：采集至少3只SPF公鸡（如没有，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡）的血液与等体积PBS液混合，将混合液10ml装入带刻度离心管II.洗涤鸡红细胞：将离心管放入离心机中，经2000r/min，离心4-5min，弃上清液与白细胞，

5、将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，如此反复离心三次，第四次离心时2500r/min，离心5minIII.配置1%鸡红细胞：99ml生理盐水或PBS+1ml洗涤完毕的鸡红细胞。3.血凝试验I.用PBS（生理盐水）铺板：在96孔血凝板中，每孔加入25ulPBS缓冲液。II.倍比稀释：吸取25ul待检样品加入第1纵排孔中，吹打15下后吸取25ul再加入第2纵排孔，再吹打15下，吸取25ul加入第3纵排孔中，依次类推，直至第11纵排孔，吹打混匀后吸25ul弃去，第12纵排为红细胞对照。III.加红细胞：加1%红细胞，每孔25微升IV.孵育：37Ԩ温箱或

6、者室温反应20-40分钟左右V.读数：以出现完全凝集的孔作为病毒的血凝滴度。Master_2010_01_05.ppt5血凝血抑试验具体步骤血凝试验结果判定：1.将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞平铺孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。2.能使鸡红细胞完全凝集的抗原的最高稀释倍数，称为该抗原滴度红细胞凝集效价。如下图第8孔红细胞为完全凝集，说明该抗原效价为1：256血凝试验主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试

7、验所用病毒的稀释倍数（抗原单位）Master_2010_01_05.ppt6血凝血抑试验具体步骤4.4单位抗原制备：根据抗原效价结果配置相应比例的抗原稀释液，即4单位抗原。如上图抗原效价为1：256，HI试验时，25ul抗原稀释液内须含4个凝集单位，则应将抗原做256/4=64倍稀释。即取100ul抗原，加入6400ulPBS液混匀（注：有些用户可能需要做4单位抗原校正，即验证4单位抗原是否配置准确）5.血凝抑制试验I.用PBS（生理盐水）铺板：在96孔板中，每孔加入25ulPBS缓冲液II.倍比稀释：吸取25ul待检样品加入第1纵排孔中，

8、吹打混匀，倍比稀释至第11纵排孔，吹打混匀后吸25ul弃去，第12纵排为红细胞对照III.加抗原：将配置好的4单位抗原加入96孔板中，每孔25ul，混匀IV.室温静置30minV