核酸序列分析、生物芯片技术.ppt

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1、1第四章核酸序列分析2DNA测序技术是分子生物学基本技术之一。测定并分析核酸的序列，是研究其结构、功能及其相互关系的前提，是分子生物学最基本的课题，并为临床疾病的分子诊断提供最为精确的判定依据。3本章内容1、第一代DNA测序技术2、第二代测序技术3、第三代测序技术的发展趋势41、第一代DNA测序技术1977年Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。51）双脱氧链末端终止法测序原理生物化学（第3版）图1DNA合成原理图6DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3’-OH末端上进行的。由于2’，3’-双脱氧三磷酸核苷酸（ddN

2、TP）的3’-位脱氧而失去游离-OH，当它掺入到DNA链后，3’-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。7利用DNA聚合酶，以单链DNA为模板，以4种dNTP为底物，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序列梯度的互补DNA链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。8图2双脱氧链末端终止法测序原理19图3双脱氧链末端终止法测序原理2102）测序体系待测模板（单链或双链DNA）测序引物DNA聚合酶（Klenow片段、测序酶、TaqDNA聚

3、合酶）dNTP和ddNTP荧光标记DNA片段的凝胶电泳113）方法特点该法测定的序列是酶促反应生成的产物，其准确性可能受碱基错误掺入的影响，并且难以分析有碱基修饰和存在二级结构的DNA样品。一次反应可测500个以上的碱基序列；具有方法简便快速，便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要等特点，在DNA序列分析中得到最广泛的应用。124）自动化测序以全自动化操作系统代替传统的手工操作，以荧光染料标记代替传统的放射性核素标记，以PCR循环测序反应为主导方法代替传统的酶反应方法，以集束化的毛细管电泳代替传统的凝胶电泳，以高速自动化的序列分析系统代替传统的人工识读等。

4、具有简单、安全、精确、并行和高效等特点。13自动化测序系统基于单一荧光染料标记的自动化测序系统基于多种荧光染料标记的自动化测序系统14基于单一荧光染料标记的自动化测序系统15基于多种荧光染料标记的自动化测序系统162、第二代测序技术尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。1）第2代测序技术的原理建立文库产生DN

5、A簇测序（1）Roche公司的454测序技术① 待测DNA文库的构建：把待测序列用喷雾法打断成300-800 bp的小片段，构建单链DNA(ssDNA)文库。② Emulsion PCR：将ssDNA与水油包被的磁珠一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，ssDNA会特异地连接到磁珠上。同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个与磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增,扩增产物仍可以结合到磁珠上。反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。1819③

6、 测序：焦磷酸测序技术测序引物与单链DNA模板退火后，通过DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶等四种酶的级联反应，将每一个dNTP的掺入与一次荧光信号的释放偶联起来，以荧光信号的形式实时记录DNA模板的核苷酸序列。20分子诊断学（第2版）图5焦磷酸测序技术原理21Pyrosequencing图1.454测序技术流程454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物(homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。也正是因为这个原因，454技术主要的

7、错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。（2）Illumina公司的Solexa技术① 待测DNA文库的构建把待测序列打断成200-500 bp的小片段，并在小片段两端加上不同的接头，连接载体，构建ssDNA文库。②Bridge PCR：DNA与流动槽的附着将这些ssDNA随机地附着在流动槽表面的channel上。流动槽是一种含有8个channel的微纤维板，它的表面固定有很多接头，能支持ssDNA在其表面以