第七章 化学酶工程ppt课件.ppt

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1、第七章化学酶工程前言一．酶的化学修饰原因1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．酶的主要动力学性质的不适应—易受产物和抑制剂抑制。3．体外的反应条件不在其最适反应条件范围内。4．临床应用的特殊要求不符合—体内使用时候，异体蛋白抗原性、蛋白水解酶、半衰期短、不能在靶部位有效聚集。教学重点：酶分子化学修饰的原理；酶分子化学修饰的方法7.1.酶化学修饰定义：在较温和条件下，以可控方式使酶同某些化学试剂发生特异反应，引起酶分子中某些基团发生共价的化学改变的过程（狭义）。凡通过化学基团的引入或除去，而使酶蛋白共价结构发生改变，称为酶蛋白的化

2、学修饰（广义）。酶修饰的方向1．蛋白质水平（化学修饰）2．核酸水平1．酶经化学修饰后，能减少由于内部平衡力被破坏而引起的酶分子伸展，增强酶天然构象的稳定性；2．酶表面形成缓冲外壳，抵御外界环境，维护酶活性部位稳定性。3．大分子修饰剂产生的空间障碍遮盖酶活性部位或敏感键，增加酶抗抑制剂、抗蛋白水解酶的能力。4．修饰可破坏抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低或消失。7.1.2．酶化学修饰的内在机制及原理☆酶分子化学修饰的基本要求1．酶性质的了解2．修饰剂的选择3．修饰反应条件的选择4.修饰反应的定性定量检测1．酶性质的了解1．酶活性部位情况2

3、．酶的稳定条件、酶反应最适条件3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。2．修饰剂的选择1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性。2．修饰剂上反应基团的数目及位置。3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件。3．修饰反应条件的选择1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例。2．反应体系的pH条件、溶剂性质，离子强度。3．反应温度及时间。4.修饰反应的定性定量检测需建立适当的方法对反应进程进行跟踪，获得一系列有关修饰反应的数据；以确定修饰程度和部位。间接分析法，被修饰的残基经分离纯化后，通过其含有的同位素标记量或有色修饰剂的光谱强度、荧光

4、标记量来测定反应程度。对修饰部位进行鉴定，需要被修饰的酶蛋白经总降解和氨基酸分析。7.1.1—7.1.2小结化学修饰原因酶修饰的方向基本原理酶分子化学修饰的基本要求1．稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2．酶的主要动力学性质的不适应。3．体外的反应条件不在其最适反应条件范围内。4．临床应用的特殊要求不符合。核酸水平蛋白质水平1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性2．酶表面形成缓冲外壳，抵御外界环境，维护酶活性部位稳定性。3．大分子修饰剂产生的空间障碍遮盖酶活性部位或敏感键，增加酶抗抑制剂、抗失活因子能力。4．修饰可破坏抗原决定簇的结构，

5、使酶抗原性降低或消失。酶性质的了解修饰剂的选择修饰反应条件的选择修饰反应定性定量检测7.1.3酶分子化学修饰的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰（1）几种重要的修饰反应（2）特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰2.酶分子的亲和标记3.大分子结合修饰聚乙二醇右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯糖肽具有生物活性的大分子物质4.酶分子的化学交联1.酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链上有各种不同的活泼功能基团，可与一些试剂发生化学反应，达到对酶分子进行化学修饰的目的。一．几种重要的修饰反应二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰三.研究新热点（扩展）一．几种重要的

6、修饰反应1．酰化反应酶分子侧链基团的酰化反应2．烷基化反应修饰剂特点：带有活泼的卤素原子，卤素原子的电负性使烷基带有部分正电荷，容易导致酶分子的亲核基团发生烷基化。亲核基团：亲近核的基团,核,来自于原子核这个概念，带正电。即：亲近正电荷的基团，据异性相吸，这样的基团带负电荷。2,4-二硝基氟苯碘乙酸3．氧化和还原反应具有氧化性的试剂，能将侧链基团氧化（在修饰反应中要控制好反应条件，以免强氧化剂使肽链发生断裂）受氧化反应作用的侧链基团：巯基，硫醚基，咪唑基，酚基还原剂：β-巯基乙醇，二硫苏糖醇（主要作用于酶分子中二硫键的修饰试剂）酶分子

7、中巯基的可逆保护反应（连四硫酸钠或连四硫酸钾）4．芳香环取代反应四硝基甲烷酶分子酪氨酸残基的酚羟基在苯环3和5位上容易发生亲电取代的硝化和碘化反应3-硝基酪氨酸衍生物，具有特殊光谱，用于直接的定量测定二．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰酶分子侧链上的功能基团：氨基，羧基，巯基，咪唑基，胍基，吲哚基，酚基，羟基，硫醚基，二硫键。1．氨基的化学修饰--赖氨酸侧链ε-氨基是酶分子中亲核反应活性很高的基团。2．羧基的化学修饰3．巯基的化学修饰：具有很强的亲核性专一性强的巯基修饰剂最常用的定量酶分子中巯基数目的修饰剂（Ellman试剂）可溶性的

8、N-乙基马来酰亚胺敏感型融合蛋白受体；定位在高尔基体中，通过膜泡融合调节内体运输。4．咪唑基的化学修饰5．胍基的化学修饰6.二硫键的化学修饰β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）三.研究热点-核酸类酶的修饰RNA酶的侧链基团