ch03基因工程工具酶ppt课件.ppt

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1、Chapter03基因工程工具酶§3.1限制性内切酶§3.2DNA聚合酶§3.3其他分子克隆工具酶3.1限制性内切酶(RestrictionEndonuclease)3.1.1限制与修饰（Restrictionandmodification）现象限制：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。修饰：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。3.1.2限制性核酸内切酶的概念是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。至2019年2月共

2、发现3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导的3种，商品化的609种，II型中共有223种特异性。①第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名(genus)②第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)③第四个字母代表宿主菌的株或型(strain)④罗马字母表示发现和分离的先后顺序3.1.3限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则：属名种名株名Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Ⅱ型（typeⅡ）：限制酶一般是同源二聚体，修饰酶是单体，9

3、3%Ⅰ型（typeⅠ）：限制酶、甲基化酶识别DNA序列的S亚基，1%Ⅲ型（typeⅢ）：不到1%3.1.4限制与修饰系统的种类3.1.5限制酶识别的序列3.1.5.1限制酶识别序列的长度及结构限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基4个碱基识别位点：Sau3AⅠ 5个：EcoRⅡNciⅠ6个：EcoRⅠHindⅢ  7个：BbvCⅠPpuMⅠ  8个：NotⅠSfiⅠ限制酶识别序列的结构（1）限制酶识别的序列大多数为回文对称结构（2）识别序列不是对称的（3）可识别多种序列3.1.5.3酶切位点（1）限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置大多数在内部（2）位点偏爱（S

4、itepreference）位点偏爱：对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象。（3）酶切位点在基因组中分布的不均一性（4）酶切位点的引入3.1.6限制酶产生的末端（1）限制酶产生匹配粘端（matchedends）（2）限制酶产生平末端（Bluntend）（3）限制酶产生非对称突出端（4）同裂酶（5）同尾酶Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-100mmol/LDTT1mmol/LVolume20-100μLTemperature37℃Time1-1.5h◆1个单位限制性核酸内切酶3.1.7酶切反应条件3.1.7.1缓冲液常规缓冲液一般包

5、括提供稳定pH值（7.0-7.9）的缓冲剂、Mg++、DTT（二硫苏糖醇）以及BSA。3.1.7.2反应温度大多数为37℃3.1.7.3反应时间反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。3.1.7.4终止酶切的方法EDTA加热①DNA样品的纯度②DNA样品的甲基化程度③酶切反应的温度④DNA分子结构（底物构象）⑤核酸内切酶的缓冲液3.1.7.5影响酶活性的因素Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性(staractivity)在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列,降低酶切反应的特异性,这种改变的特殊性称为限制性核酸内切酶的星活性。3.1.8星星活性（s

6、taractivity）星星活性产生的原因如下：①反应体系中甘油的浓度过高②酶用量过大③低离子强度④高pH⑤含有机溶剂⑥非Mg2+的二价离子的存在。①在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性酶片段②建立DNA分子的限制酶图谱③构建基因文库④用限制酶切出的相同粘性末端，以便重组⑤改建质粒3.1.9Ⅱ限制性核酸内切酶的主要用途①每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%②整个操作应在0℃进行，最后加入酶③切割大量DNA时，延长反应时间，减少酶的用量④应用通用缓冲液3.1.10Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项3.2DNA聚合酶(DNApolymerase)3.2.1大肠杆

7、菌DNA聚合酶Ⅰ（E.coliDNApolymeraseⅠ）3.2.1.1E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性     ①5‘--3’DNA聚合酶活性②5‘--3’外切酶活性③3'--5'外切酶活性3.2.1.2E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途①切口平移法（nicktranslation）标记DNA②用于cDNA克隆中的第二链3.2.2KlenowDNA聚合酶（1）Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶