免疫组化染色步骤.docx

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1、免疫组化染色步骤冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织　　将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。　　冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。　　室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。　　PBS洗，5分钟×3。　　用3%

2、过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。　　PBS洗，5分钟×3。　　下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）　　1.石蜡切片脱蜡至水。　　2.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。　　3.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。　　4.5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。　　5.PBS冲洗，2分钟×3次。　　6.滴加适当比例稀释

3、的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。　　7.PBS冲洗，2分钟×3次。　　8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。　　9.PBS冲洗，2分钟×3次。　　10.显色剂显色（DAB或AEC）。　　11.自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）　　1.石蜡切片脱蜡至水。　　2.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如

4、需采用抗原修复，可在此步后进行。　　3.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。　　4.滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。　　5.PBS冲洗，2分钟×3次。　　6.滴加试剂1（PolymerHelper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。　　7.滴加试剂2（polyperoxidase-anti-mouse/rabbitIgG），室温或37℃孵育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。　　8.PBS冲洗，2分钟×3次。　　9.显色剂显色（DAB或AE

5、C）。　　10.自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。荧光抗体染色方法　　免疫荧光染色方法注意是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能的小，不溶解或不变性，原有位置不扩散或不移位。因此，对标本的处理一般速度要快，温度要低。恒冷切片和涂片较为理想。因此，抗体溶液的pH值和反应温度越低，孵育的时间越长。一般37℃时需要25~60分钟。若要作细致观察或者当天不能进行染色标本的观察，可在5℃中过夜，但染色标本最好是当天观察。1、直接染色法直接染色法是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应，是免疫荧光技术中最基本、最简单的染色

6、方法。　（1）固定：切片或涂片标本用95℃乙醇或丙酮固定。　（2）冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。　（3）染色：滴加相应的荧光抗体液，将标本放入带有湿纱布的搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。　（4）冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。　（5）观察：标本晾干或者加介质（缓冲甘油液）和盖片观察。直接法首次试验时需作以下对照：　　标本加正常未免疫的同种动物的标记球蛋白溶液进行染色，呈阴性反应。标本先加同类未标记抗体作用30分钟后，PBS冲洗，再加荧光标记抗体染色。因标记内抗原已未标记的特异性抗体反应，不再与荧光抗体结合，所以应呈现阴性反应。2、间接染色法间接染色法分双层法和

7、夹层法（1）双层法：双层法主要定位抗原和鉴定未知抗体。　　①固定：标记用丙酮或95%乙醇固定。　　②冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。　　③第一次作用：被检标本滴加未标记的第一抗体液，并将其放入带有湿纱布的搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。　　④冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。　　⑤第二次作用：标本滴加荧光抗体（抗体Ⅱ）液，再放入湿搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。　　⑥冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。　　⑦观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。首次试验时需作以下对照：　　①标本直接滴加抗免疫球蛋白荧光抗体，呈阴性反应。　　②标本加同