流式细胞检测技术讲座ppt课件.ppt

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1、流式细胞技术原理及其在临床&科研中的应用（FlowCytometry,FCM)北京利文商贸有限责任公司李建廷主要内容流式细胞技术概念流式细胞技术原理流式实验的设计流式细胞技术在临床&科研上的应用流式细胞技术概述流式细胞技术的概念流式细胞技术的特点流式细胞仪的检测范围BD公司流式细胞仪流式细胞仪的结构什么是FCM？流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术FCM的特点测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞可进行多参数测量：可以对同一

2、个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况高分辨率(CV<2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF，前向角散射光检测灵敏度(0.2∼0.5um)既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体BD公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSA

3、ria流式细胞仪的结构光路：1、激光光源及光束成形系统：氩离子(488nm)红色氦氖激光(633nm)2、光学系统：透镜、滤光片、小孔液路——流动室及液流驱动系统（鞘流原理）信号检测与分析：光电倍增管(PMT)、补偿电路存储、显示、分析系统：计算机细胞分选系统流式细胞技术原理荧光发生机理及荧光光谱滤光片散射光信号的检测荧光信号的检测数据的储存与分析荧光及荧光发生机理简介荧光及荧光素：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线——即荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素荧光发生机理：室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在

4、一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在10-9～10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。荧光素的激发和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission，Em）：是指某一波长激发光引起荧光素

5、发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：选择正确的激光器确定所需荧光探测器（PMT）488nm520nm异硫氰酸荧光素（FITC）LongpassShortpassBandpass460500540460500540475500525SP500LP500BP500/50光学系统：滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围荧光光谱示意图散射光信号FSCSensorLaserSSCSensor散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetecto

6、rCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）反应细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）反应细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）流式细胞仪的荧光检测信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量数据分析数据存储:LISTMODE数据显示:直方图(Histogram)二维点图(DotPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(Density)三维图（3DP

7、lot）等数据分析直方图分析点图分析数据分析数据分析等高图和密度图分析数据分析三维图分析流式实验设计原则常用荧光标记探针常用仪器荧光通道分布实验对照、同型对照、补偿对照荧光与抗体的搭配小结常用的单克隆抗体荧光标记探针488nm激光激发：FITC（异硫氰酸荧光素）：荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱PE（藻红蛋白）PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上PerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物）PE-Cy7（藻红蛋白偶联物）PE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome）PE-TexasRed（

8、藻红蛋白-德州红偶联物，