研究生电镜课作业

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1、早期地塞米松应用对豚鼠慢性哮喘模型气道重塑影响的电镜学研究气道重塑是支气管哮喘的病理特征之一,但对哮喘何时开始出现这种改变不清楚。本研究拟利用急性动物模型进一步从病理学角度探讨支气管哮喘发病早期是否就开始了气道重塑的改变以及早期应用地塞米松能否抑制这种改变的发生。目的是探讨早期应用地塞米松在哮喘治疗是否有积极的作用。研究内容及研究方案设计：一．慢性哮喘模型的构建：取200g左右的健康豚鼠随机分成3组:正常组、哮喘组、地塞米松组,每组3只。所有哮喘组和地塞米松组均于实验第1天腹腔注射10%的卵清白蛋白(OVA)1mL,2

2、周后把豚鼠置于密闭的玻璃雾化罩内以1%的OVA雾化诱喘,每日1次，连续5d，每次诱喘至豚鼠发绀,痉挛性咳漱;地塞米松组豚鼠每次雾化诱喘后30min腹腔注射地塞米松，2mg/kg体重；正常组豚鼠用生理盐水代替卵蛋白致敏和诱喘。2周后取正常组、哮喘组、地塞米松组豚鼠制备标本。二.电子显微镜下观察地塞米松处理前后气道重塑的病理改变1.固定及取材：每组3例，2%戊巴比妥钠按2～3ml/kg体重腹腔麻醉。剪开颈部皮肤,暴露气管并用手术缝合线在其下1/3处结扎紧,速在颈部上1/3处断头放血后,快速将胸腔打开取出全肺,用生理盐水冲洗

3、肺外表面,并放入洁净平皿内,用装有固定液的注射器从结扎气管线下面刺入管腔内缓慢注入固定剂,此时气管开口应朝上方以防液体流出,待整个肺的下3/4膨胀时停止注入固定液并用手术线于针口下面将气管结扎紧固,将全肺投入固定液内浸泡固定15-30min后，将其转移入后固定液中固定2-4h。固定好的组织要首先进行修块，修块时尽量取靠近肺门处的组织，而且体积应当比较小，一般体积为1mm3在此操作过程中要注意以下事项：1）固定时一定要掌握快的原则，慢了容易使组织变性，灌注用的固定液要提前放在4℃冰箱中预冷，以尽量保证组织的结构保持原始状

4、态；2）固定好的组织要首先进行修块，修块时尽量取靠近肺门处的组织，也即取材要准；3）取材的体积应当比较小，一般不应超过1mm3，以便于液体能彻底渗透到组织的内部，保证最后图像的观察效果；4）固定、取材及切片均应在低温下或冰上进行，也即保持组织处于冷的条件下，以尽量保持组织的原始状态；5）固定、取材、切片及后续的实验中都要掌握轻拿轻放的原则，尽量减少实验操作对超微结构的损伤。总之，在以上实验中一定要掌握五字原则，即“快、准、小、冷、轻”。3.饿酸处理：饿酸处理增加图像的对比度4.脱水、浸透及包埋：脱水----50%，70

5、%，80%，90%，100%丙酮脱水给15min，然后100%丙酮2次，10min/次；浸透---丙酮：包埋液=1：1,37℃2h；包埋---65℃烘箱2h。5.超薄切片制作：切片的的厚度一般50-70nm。6.电子染色：醋酸釉中进行电子染色1h。最后电镜观察哮喘组与正常组相比，肺泡壁增厚多少、肺泡细胞形态发生哪些改变、上皮细胞内的线粒体及内质网的形态是否发生变化、上皮细胞下胶原细胞及成纤维细胞的增生程度；然后观察地塞米松与哮喘组相比增厚的肺泡壁是否得以修复、肺泡细胞及上皮细胞内的细胞器的形态变化是否得以修复、上皮细胞

6、下胶原细胞及成纤维细胞的增生程度是否得以减轻。