RNAi作用机制备课讲稿.pptx

《RNAi作用机制备课讲稿.pptx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、RNAi的作用机制RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行：(1)siRNA的形成阶段；(2)RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)形成阶段；(3)效应阶段；(4)扩增阶段。RNAi机制外源病毒转座子目标识别内切酶切割目标外切酶降解RNARdRP合成RNA激活的siRNA复合物双链siRNA异常ssRNARdRP合成RNA二级siRNA核酸内切酶核酸外切酶解旋酶Dicer同源搜索活性siRNAslongdsRNADicercontainstwoRNAseIIIdomainsDicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切

2、修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21~25nt大小在3’端带有2~3个碱基悬端和5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。19ntduplex2nt3’overhangssiRNAshaveadefinedstructuresiRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNaseⅢ核糖核

3、酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt~23nt的siRNA呢?最近对RNaseⅢ催化结构域的结构的研究使其真相大白。Dicer一种核酸酶,负责将dsRNA转化为siRNA：它属于RNaseⅢ家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,

4、其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。DicerModelsforDicercleavage启始阶段加工酶加工成21-23核苷酸片段DicerRISCmRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解①②siRNA的形成siRNADicerRISC(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段生成的siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNA-i

5、nducedsilencingcomplex），具有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)(3)效应阶段siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5’起始端下游7~10个核苷酸处切断

6、mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。效应阶段mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解解旋酶核酸外切酶同源性检索活性核酸内切酶RISC在这些机制中，RISC是一个很灵活的平台，在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能。RISC复合物的核心负责接受从Dicer加工来的小RNA，并用该小RNA作为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生。RISC（RNA-inducedSilencingComplex）解旋酶核酸内切酶ArgonauteproteinsiRNAmRNA250KD(inactive)100KD(active)ATP9/19/2021(4)扩增阶段该反

7、应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。RNAi扩大效应目前，对这些现象的解释至少有四种机制：①Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初