病原生物实验.docx

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1、病原生物学实验指导实验一显微镜的使用及细菌的观察一、显微镜油镜的使用和保护目的熟练掌握显微镜油镜的使用和保护，以便能娴熟应用油镜观察细菌材料标本。原理细菌个体微小，肉眼不能看到，必须使用油镜，将其放大1000倍左右才能看到。如光线直接从标本玻片经空气层进入油镜头时，由于介质密度不同发生折射现象，因此进入物镜中的光线很少，结果视野暗淡，物像不清晰。如在标本玻片上加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515），就可避免光线的分散，加强视野的亮度，获得清晰的物像（见图1）。材料附有油镜头的普通光学显微镜一架，染色标本片，香柏油，擦镜纸，二甲苯，消

2、毒缸。方法步骤（一）使用法1．油镜的识别油镜头上都有标记，标有90×或100×；镜头前端有黑、白或红色的圆圈：刻有“HI”或“oil”等，其孔径也较其他物镜小，约帽针头大。2．油镜的使用(1)用油镜观察标本时应将显微镜直立，勿将镜臂弯曲，以免镜油流散。(2)以天然光线为光源时，使用平面反光镜，如以灯光为光源，使用凹面反光镜。(3)将聚光器升到最高位置，再将光圈完全打开，增大射入光线的强度。(4)标本固定在载物台上，标本面上加镜油1小滴，用标本移动器夹紧标本。(5)先用低倍镜将视野调至最亮时，并找到标本的适当位置，然后换用油镜。(6)用眼从侧方看着物镜，缓慢

3、转动粗调节器，使物镜头浸于油滴内，并几乎与玻片接触为止，但切勿使两者相碰，防止损伤镜头或压碎玻片；然后从目镜观察，轻轻转动粗调节器，看到物像时，再调换细调节器，使物像清晰。未能看到物像时，再重复上述操作。(7)油镜头使用后立即用拭镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在试镜纸上滴少许二甲苯擦试，并随即用干的试镜纸擦去二甲苯，以防镜片脱落。（二）油镜的保护1．显微镜是贵重精密仪器，使用时要精心爱护，不得随意拆散和碰撞。2．取送显微镜时，应右手持镜臂，左手托镜座，平端于胸前，然后轻放于台面上或柜箱内。3．防止与强酸、强碱、乙醚、氯仿、酒精等化学药品接触。4．擦镜头时

4、，用试镜纸擦，切忌使用粗糙的纸片或布片擦试等。擦镜时应顺其直径方向擦，不要转圈擦。5．不用时，将物镜转开呈八字，使其不正对聚光器，以免物镜与聚光器相碰撞。将聚光器下降，罩上镜套或盖布，对号归位。思考题1．怎样操作才能使显微镜的视野最亮？标本最清晰？2．使用油镜应注意哪些主要事项？二、细菌材料玻片标本制备（操作）目的细菌材料需涂布固定于玻片上，然后经染色才能观察其形态、结构及染色反应。原理细菌为胶体原浆蛋白为主，涂布在玻片上经火焰温热后可固定于玻片，再经染色冲洗既可被染上颜色，且不易被水冲洗掉。材料葡萄球菌、大肠杆菌培养物、玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、火

5、柴、消毒缸。方法步骤按涂片→干燥→固定顺序进行。1．涂片取洁净载玻片1张，用接种环取1~2环生理盐水置于玻片，接种环灭菌后取菌少许，与盐水混匀并涂成面积不超过1cm2的薄膜。如用液体培养物涂片，可直接取培养物涂于玻片上，不加生理盐水。2．干燥将涂片放空气中自然干燥，或将标本面向上，放在离火焰较远处烘干，避免烤焦。3．固定手持载玻片一端，将涂片在火焰高处连续通过3次，约2～3秒，就可固定标本。注意事项1．玻片要洁净无油，否则菌液不易涂开。不宜选用厚玻片，以免标本观察时视野难调清晰。2．取菌量宜少，涂上要均而薄3．水洗时要以细流水徐缓冲洗，避免直接冲洗涂菌处，

6、要切忌未经火焰固定的标本立即染色水洗。思考题涂片后为什么必须进行固定？固定时应注意什么？三、细菌的革兰染色法（操作）目的革兰染色法是最常用的细菌鉴别染色法，根据染色结果将细菌分成两大类，即革兰阳性菌和革兰阴性菌，此有助于细菌鉴别、分析细菌的结构特点、致病性和选用抗菌药物提供依据。原理由于两大类细菌细胞壁成分和结构不同。革兰阴性菌细胞壁中有较多的类脂质，而肽聚糖含量较少。当用酒精脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞的渗透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞脱色，经复染后，染上复染液的颜色。而革兰阳性菌细胞壁中肽聚糖含量多且交联度大，类脂质含量少，经酒精脱色

7、后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，细胞仍保留结晶紫的颜色。材料1．葡萄球菌和大肠杆菌18～24小时培养后的混合菌液。2．革兰染色液一套。3．其它材料同玻片标本制备法。方法步骤涂片→干燥→固定后按以下顺序染色。1．初染滴加结晶紫染液数滴于标本面上，染色1分钟，轻轻水洗，甩干。2．媒染滴加卢戈氏碘液数滴于标本面上，染色1分钟，轻轻水洗，甩干。3．脱色滴加95%酒精于标本面上，频频倾动玻片，直到不再溶下染料为止，约半分钟，视标本片材料厚薄而增减时间，然后水洗、甩干。4．复染加稀释石炭酸复红液于标本面上，染1/2～1分钟，水洗后甩干，用毛边纸或滤纸轻轻吸干，待标

8、本充分干燥后加油，用油镜观察并绘图。提示：经革兰染色后，显紫色者为