安徽农业大学基因工程.doc

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1、复习题1.为什么说基因工程技术是上世纪60年代末70年代初发展起来的？因为：（1）1967年发现了连接酶；（2）大肠杆菌的转化技术是1970年获得突破；（3）限制性内切核酸酶的分离始于1970年；（4）Berg在1972年构建了第一个重组的DNA分子。2.重组DNA的含义是什么？将一个生物的DNA片段插入到一个载体中，并引入到另一个生物体中进行繁殖。3.限制性内切核酸酶的切割频率？切割频率是指限制性内切核酸酶在DNA分子中预测的切点数。假定DNA分子中4种碱基的频率相同，且限制性内切酶的识别位点随机分布，那么任何一种限

2、制酶的切割频率，理论上应为1/4n，n为该限制酶识别的碱基数。4.什么是细菌的限制-修饰系统？它有什么意义？细菌中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，这两种酶作用于同一DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为R-Msystem。不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的R-Msystem。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割，而外来的DNA在相应的碱基上没有

3、被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA的限制和修饰作用为细菌提供了保护，它是通过对外源DNA的限制和对自身DNA的修饰实现的。5.碱性磷酸酶的种类、差别及用途？CIP的活性比BAP高10-20倍，且加热到68℃就可完全失活，而BAP却是耐热酶，耐酚抽提。用途：（1）dsDNA的5’端脱磷酸，防止线性载体DNA的自身环化。（2）DNA和RNA脱磷酸后，用于多核苷酸激酶进行5’末端标记。6.如何利用T4DNA聚合酶制备平末端？T4DNA聚合酶具有5，-3，合成酶活性和

4、3，-5，外切核酸酶活性，并且在高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止。根据这一特性可以调整反应条件，用T4DNA聚合酶的3，-5，外切酶活性将具有3，突出末端的双链DNA切成平末端；用T4DNA聚合酶的5，-3，合成酶活性将具有5，突出末端的双链DNA填补成平末端。（而Klenow酶是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶经枯草杆菌蛋白酶水解之后，产生的分子量为76kDa的大片段分子。Klenow酶仍具有5，-3，的聚合酶活性和3，-5，的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5，-3，的核酸外切酶活性，且3，-5，的核酸外切酶活性

5、很弱，故仅可对3’，-隐蔽末端的双链DNA填补成平末端。）7.理想质粒载体必须具备的条件？（1）具有复制起点，这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，可使繁殖后的细胞维持一定的质粒拷贝数。（2）带有抗菌素抗性基因，最好具有两种抗菌素抗性基因，且抗性基因内有若干单一的酶切位点，便于利用插入失活法筛选重组体。（3）具有若干限制酶单一识别位点，这样可以有选择地供带有不同末端的外源DNA定点插入。（4）较小的分子量和较高的拷贝数，小分子量的质粒易于操作，更能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源DNA片段也更长（不超过15kb），且可

6、有效地转化给受体细胞；小分子量的质粒往往属于松弛型质粒，在细胞中拷贝数较高，扩增后回收率高。8.质粒改造包括哪些基本内容？a.删除一些非必要区段及对宿主有不良影响的区段，削减载体分子量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力；b.加上易于选择或检测的标记；c.限制性内切酶酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置；d.加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达；e.安全性改造，限定载体的宿主范围。9.为什么野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？野生型的λ噬菌体DNA，分子量大，对常用的核酸内切限制酶具有过多的酶切

7、位点（如5个EcoRⅠ限制位点，7个HindⅢ限制位点），没有选择标记，而且具有感染性，显然它本不适于用作基因克隆的载体，因此有必要将λ噬菌体的非必要（J基因到N基因）区段和多余的酶切位点进行删除，以便改造成适用的克隆载体。10.黏粒载体具有哪些特点与不足？a.柯斯质粒载体具有质粒复制子，因此进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能在氯霉素作用下进一步扩增。b.具有质粒载体的抗生素抗性基因。c.具有λ噬菌体的包装和转导特性。d.容载能力大。克隆的最大片段为45kb，最小片段为19kb。用cosmid进行克隆时有两个

8、缺点：（1）两个或多个cosmid分子之间的重组，即自我重组降低了重组率。（2）两个或多个外源DNA片段同时插入。1.PCR的基本原理是什么？PCR反应是在模板DNA、引物和dNTPs存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应，它根据DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性（退火）和引物延伸反应。2.欲扩增下图所示