心肌肥厚实验方案

心肌肥厚实验方案

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时间:2017-12-28

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1、一、实验方法1L-甲状腺素致大鼠心肌肥厚模型取50只220-250gSD雄性大鼠,随机分为6组,每组10只。分别为:空白组、模型组、玄参高剂量组、玄参中剂量组、玄参低剂量组、卡托普利(阳性对照药)。制备大鼠心肌肥厚模型。除正常组外,各组连续7d腹腔注射L-甲状腺素0.25mg·kg-1·d-1,1次/天,制成心肌肥厚模型;正常组腹腔注射等量注射生理盐水。各给药组在给予L-甲状腺素后以玄参高、中、低液灌胃给药;正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃。连续给药9天,于处理前禁食不禁水12h,取血和心肌进行

2、各项分析。2大鼠心肌质量指数的测定大鼠心肌肥厚指数的测定:取大鼠称体重(BW)后腹主动脉取血。快速打开胸腔取心脏,去除心房组织,分离左、右心室,生理盐水漂洗去血,用滤纸吸干表面水分,电子天平准确称取左心室重量和全心重量。计算左心室重量/体重(LVW/BW)、全心重量/体重(HW/BW),分别记为左心室肥厚指数(LVWI)、全心肥厚指数(HWI)。3心肌组织AngⅡ含量的测定组织匀浆制备:各组大鼠取血后,取左心室心肌组织约300mg/份,在4℃的生理盐水中漂洗2次,除去血液,滤汁拭干。用分析天平称重

3、,迅速置于冰浴中的微型手动匀浆器中,加入重量为组织重量9倍的4℃生理盐水,碾磨约10min制成匀浆,以3000r/min离心15min,取上清液置-70℃冰箱保存,待测。取上清液200ul加生理盐水800ul制备成2%的心肌组织匀浆。按血管紧张素Ⅱ试剂盒说明书及考马斯亮蓝蛋白测试盒说明书进行操作,测定AngⅡ及蛋白浓度,结果以每毫克蛋白中的AngⅡ含量表示。4心肌组织SOD、MDA活性测定去上清液,配置成一定浓度的组织匀浆,严格按照试剂盒说明书,用分光光度法检测心肌超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛

4、(MDA)含量。同时进行蛋白测定,按考马斯亮蓝蛋白测试盒说明书操作。结果以每毫克蛋白中的SOD活性表示。5心房利钠肽ANP的含量测定血清ANP含量测定:用ELESA法测定,常规方法取血并分离血清,严格按照试剂盒说明操作。二、造模方法的依据甲状腺素可以素激活了循环和组织中的RAS,使血管紧张素Ⅱ的含量增加;增加肾上腺素能受体的表达;L-Thy诱导的心肌重构具有缺血缺氧性损伤的特点,心肌线粒体中SOD活性降低,MDA含量升高。(1)甲状腺素激活了循环和组织中的RAS,在体内和离体实验中均发现甲状腺素直

5、接刺激了肾素mRNA,加速了血管紧张素原的合成和分泌,血管紧张素(AngⅡ)生成增加,同时AngⅡ受体数目上调。AngⅡ是肾素血管紧张素系统的主要效应激素,对心室重构起着核心的作用,局部的AngⅡ水平对重构起了决定性的作用,AngⅡ能增加细胞DNA和RNA的含量及代谢转换,增加细胞内蛋白质合成,可使心肌细胞增生、肥大,促进心脏重构肥厚。它的促肥厚作用起始于它和特异受体(如AT1受体)的结合,再经受体后的信号转导通路而完成。(2)增加肾上腺素能受体的表达,甲状腺素对儿茶酚胺等激素的作用能产生重要

6、影响,当循环中存在大量甲状腺素时,可增加肾上腺素能受体表达,,促进心肌受体数目上调及提高其对儿茶酚胺的敏感性。(3)氧化应激作用L-Thy诱导的心肌重构具有缺血缺氧性损伤的特点,实验发现,给予L-Thy后大鼠心肌线粒体中SOD活性降低,MDA含量升高且心肌线粒体中Na+,K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力均显著升高。三、所测得的指标心脏指数:是一项病理学指标,是反映左心功能不全程度较为准确的指标,所以采用动物心室重构模型时,可用心脏指数来评价左心功能不全的严重程度。超氧化物歧化酶SOD、MD

7、A:SOD是心肌组织内重要的抗氧化物酶,MDA为脂质过氧化反应的主要终产物,测定其含量可间接反应机体中自由基水平及脂质过氧化反应程度。心房利钠肽ANP:是由心房肌细胞合成和释放的一类多肽。它具有强烈的拍钠利尿的作用,并使血管平滑肌舒张,外周阻力降低,使心率减慢,心输出量减少,血压降低。此外,它还有抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用,间接的促进Na+的排泄,以及抑制血管升压素的作用。当血容量增加和血压升高时,心房肌细胞释放心房钠尿肽,引起利尿和拍钠效应。因此,它是体内调节水盐平衡的一种重要的体液

8、因素。心肌肥厚、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心肌梗死、心肌重塑、左心功能障碍和急性冠状动脉综合征患ANP和BNP水平显著升高,与美国纽约心脏病学会心功能分级和心脏猝死密切相关,是诊断心力衰竭和评估心力衰竭严重程度的生物指标。研究进一步证实,ANP和BNP是心肌肥厚的标志物心脏负荷可诱导组蛋白去乙酰化酶-4出核信号组蛋白去甲基和异染色质蛋白-1分解,促使胚胎基因ANP和BNP的再表达,导致病理性心肌肥厚和心力衰竭。血管紧张素AngⅡ:AngⅡ具有较强的致心肌纤维化的作用,它可以通

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