医学检验免疫学.docx

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1、第一节杂交瘤技术的基本原理　　第二节单克隆抗体的制备　　第三节基因工程抗体制备　　第四节单克隆抗体的应用　　将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。第一节　杂交瘤技术的基本原理　　　　杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。　　　　一、杂交瘤技术　　包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的

2、筛选与克隆化　　（一）小鼠骨髓瘤细胞　　细胞株稳定，易于传代培养　　细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子　　该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株　　（二）免疫脾细胞　　免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法　　如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫　　（三）细胞融合　　PEG（聚乙二醇）可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合　　（四）杂交瘤细胞的选择性培养　　HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷　　1.脾细胞（指B细胞）　在一般培养基中不能生长繁殖　　2.骨

3、髓瘤细胞　　因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡　　3.杂交瘤细胞　　由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞　　由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛选出来　　　　二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养　　单个细胞培养又称克隆化　　细胞克隆化有以下几种方法：　　1.有限稀释法　　2.显微操作法　　3.荧光激活细胞分选仪　　4.软琼脂平板法　　　　三、阳性杂交瘤细胞的冻存　　目前均采用液氮保存细胞第二节　单克隆抗体的制备　　　　一、单克隆抗体的两大产生方法　　（一）动物体内诱生法　　先在小鼠腹腔注射

4、液体石蜡或弗氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔，1～2周后，无菌抽取腹水，离心取上清液即可。　　（二）体外培养法　　将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。　　　　二、单克隆抗体的纯化　　从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。　　由于其中含有大量来自培养基、宿主或克隆细胞本身的一些无关蛋白，如果用于免疫标记测定，如放射性核素、酶、荧光素或生物素标记等，必须进一步分离和纯化。　　　　三、单克隆抗体的性质鉴定　　（一）Ig类型测定　　　（三）抗体效价测定　　（二）特异性测定　　

5、　（四）表位测定　　（五）亲和力测定　　（六）染色体分析　　　　四、单克隆抗体的特性　　（一）单克隆抗体的特性　　1.高度特异性　　2.高度的均一性和可重复性　　3.弱凝集反应和不呈现沉淀反应　　4.对环境敏感性　　（二）单克隆抗体的优点　　1.杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体　　2.可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体　　3.由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等　　4.由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放

6、射免疫显像和免疫导向治疗　　（三）单克隆抗体的局限性　　1.由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成　　2.单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体　　3.制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高　　第三节　基因工程抗体的制备　　　　一、基因工程抗体的概念　　应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体　　　　二、基因工程抗体的优点　　1.通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应　　2.基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利

7、于穿透血管壁，进入病灶的核心部位　　3.根据治疗的需要，制备新型抗体　　4.可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达形式，大量表达抗体分子，大大降低了生产成本　　　　三、人源化抗体　　制备人源化抗体的主要目的是减少抗体的异源性　　（一）嵌合抗体　　从杂交瘤细胞中分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区的基因连接，插入适当质粒，构建鼠-人嵌合的重链和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞（如骨髓瘤细胞），表达鼠-人嵌合抗体　　（二）改形抗体　　利用基因工程技术，将人抗体可变