高效液相色谱法测定氨基酸.doc

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1、脑蛋白水解物溶液氨基酸含量分析方法研究方案1、仪器与试药1.1仪器1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters1525型泵，Waters2487型检测器，Waters5CH型柱温箱，WatersBREEZE数据处理软件，水浴恒温器（精度±0.1℃），旋涡器，微量移液器，衍生专用管；CP225D型分析天平（德国）；4umNora-PakTMC18（3.9mm×150mm，5μm）色谱柱（美国）1.2药品与试剂16种氨基酸（门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）由中国药品生物制

2、品检定所提供。脑蛋白水解物注射液，云南盟生药业有限公司生产，规格10ml/支。批号：2013、2013、2013.乙腈（HPLC级）；EDTA（分析纯）；磷酸（分析纯）；二乙胺（分析纯）；三水合乙酸钠（分析纯）。2、方法与结果2.1色谱条件流动相A为AccQTag醋酸—磷酸盐缓冲液；由AccQTagEluentA浓缩制备AccQTag洗脱液,用前稀释10倍（或按以下方法配制：称19.04g三水合乙酸钠，加1000ml纯化水，搅拌，溶解，用50%H3PO4将pH调至5.2，加入1ml1mg/ml的EDTA溶液，加入2.37ml二乙胺，用50%H3PO4滴定至pH4.95，用水溶性过滤器过滤

3、，超声，脱气，备用。）；流动相B为60%HPLC级乙腈，按梯度表梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；进样量5μl；柱温38℃。时间(min)流速(ml/min)%A%B曲线起始1.01000*0.51.0982615.01.0937619.01.09010632.01.06535633.01.06535634.01.00100637.01.00100638.01.01000642.01.0100062.2对照品溶液、供试品溶液的制备分别精密称取16种氨基酸标准品，用纯化水配制成浓度如下表所示的混合溶液。名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）名称浓度（mg/ml）

4、门冬氨酸4.80苏氨酸1.20异亮氨酸1.10丝氨酸2.60丙氨酸2.50亮氨酸2.70谷氨酸6.20脯氨酸2.00苯丙氨酸1.20甘氨酸2.40缬氨酸1.60色氨酸0.40组氨酸0.90甲硫氨酸1.00精氨酸1.20赖氨酸3.45取上述溶液0.1ml，加纯化水0.9ml，旋涡器混匀，作为对照品溶液；取脑蛋白水解物注射液，加水稀释成含总氮为1mg/ml的溶液，取0.1ml，加纯化水0.9ml,旋涡器混匀，作为供试品溶液。衍生剂配制将水浴锅设置55℃，加热，待温度稳定,取AccQFluor衍生剂2A，轻轻弹击,确保AccQFluor衍生剂2A粉末全落在瓶底，吸取AccQFluor衍生稀释剂

5、2B1ml并放掉，清洗移液器管，再吸取AccQFluor衍生稀释剂2B1ml，加入AccQFluor衍生剂2A的瓶中，振荡10秒钟，在恒温水浴锅中溶解，保持10分钟。于干燥器中室温保存一周,于干燥器中4℃保存二周。2.3测定方法分别取20ul对照品溶液和供试品溶液加入衍生专用管底部，加入60uLAccQFluor硼酸缓冲液旋涡混匀，边混匀边加入20ul衍生剂，封口放置1分钟，放入55℃恒温水浴锅中保温10分钟，取衍生的对照溶液及供试品溶液各5ul注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每1mg（以总氮量计）中氨基酸含量。2.4准确度精密称取16氨基酸分别配制成3个浓度级别的溶液，

6、每个浓度3个样品依法测定，计算测定回收率。2.5精密度试验2.5.1系统精密度试验取同一浓度样品连续进样6次，记录峰面积与保留时间并计算RSD值（RSD≤2.0%）。2.5.2方法精密度试验平行制备6份样品，分别检测，记录峰面积与保留时间并计算RSD值（RSD≤2.0%）。2.6专属性试验取已知浓度样品检测，标明各成分在图中的位置，要求各成分基本分离。2.7线性考察试验精密称取16种氨基酸对照品制备成5份浓度不同的供试液，按照检测方法检测，以测得的峰面积作为被测物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归。求其回归方程、相关系数和线性图。2.8范围取三批样品依法检测含量，应为测试浓度的80

7、%～120%。2.9耐用性试验2.9.1稳定性取一批样品分别在0h、2h、4h、6h测定其含量，看各组分是否发生显著性变化。2.9.2样品测定取三批样品测定其含量，看是否在含量规定的范围内。起草人：钏助胜、杨茜