细菌生长曲线之测定.doc

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1、Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTU實驗六細菌生長曲線之測定◎Exp11.Turbidityofbacteria一、目的：在進行細菌生長曲線之測定前，必須先了解U-2001Spectropho-tometer操作方法，才能將細菌的數量以吸光值的方式表示出來。二、原理：請詳讀整理p.90-92，學會調整Opticaldensity(O.D.)【Exp13.會用到】。三、器材：1.culture：(每組)24hrEscherichiacoli(broth)2.medium：(每組)Nutrientbr

2、oth3.equipment：1mlpipette，pipetteaid，cuvette，拭鏡紙，廢菌液杯，裝蒸餾水的洗瓶，滅菌空試管，U-2001Spectrophotometer，振盪器。四、實驗步驟※由助教先示範操作方法，再由學生自行操作與測量待測液之吸光值。1.了解U-2001Spectrophotometer操作方法：a.溫機約15分鐘。b.MENU→(主目錄)選1.Photometer→輸入波長600nm及ABS→Forward→c.Nutrientbroth歸零autozero→(前、後二支cuvette)※1d.取出後面之cuv

3、ette，倒入待測液※2，等到右上方數據穩定後，按下Start→記錄。※1cuvette有石英管(測波長340nm以下)、玻璃管、塑膠管等材質，本實驗使用塑膠材質之比色管。※2每次測定前需先用蒸餾水滴洗cuvette，再以待測液潤濕，倒掉，再裝入待測液，測完倒掉，用蒸餾水滴洗。測定之前33Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTUcuvette須用拭鏡紙擦乾，手握管的非透明處；廢菌液請滴洗入廢菌液杯中，集中處理)。2.每組取一管助教所準備之E.coli當待測液，實際演練U-2001Spectrophot

4、ometer操作，測出其原液O.D.【Exp13.將會利用到此操作，故須熟悉其操作步驟】。◎Exp12.SerialDilution-AgarPlateProceduretoQuantitateViableCells一、目的：1.學習連續稀釋法。2.觀察活菌數。二、原理：微生物數目之計數法有：1.直接顯微鏡計數(DirectMicroscopicCounts)：以PetroffHauserchamber計數。僅計數微量菌液，再由數學方法求取總菌數，此法迅速方便但活與死菌皆涵蓋之且總菌數若低於一百萬時，準確度差。2.電子細胞計數器(Electro

5、nicCellCounters)：如CoulterCounter，此法不能區分活或死菌，也無法區別惰性顆粒物質與細胞物質。3.化學方法(ChemicalMethods)：以間接測定蛋白質濃度、DNA產量、細胞質量及代謝物等反推菌數。4.分光光度計分析(SpectrophotometricAnalysis)：利用穿透菌液之光線量，隨菌量增加而減少。此法迅速但菌數若低於一千萬時，敏感度差。5.連續稀釋-洋菜平板法(SerialDilution-AgarPlate)：此法乃計數活菌。利用無菌水對菌液做一連串稀釋，採PourPlate法進行之，經隔夜培

6、養後計數(或者使用Quebec，參考課本Figure21.4,p.89)。本實驗課中繪製細菌生長曲線之方法便是利用連續稀釋-洋菜平板法，故Exp12與細菌生長曲線之測定一併進行。33Gen.Microbiol.Lab.,2008Dept.Agri.Chem.,NTU◎Exp13.TheBacterialGrowthCurve一、目的：了解細菌的族群生長變動，繪製生長曲線(growthcurve)，並求出增代時間(generationtime)。二、原理：a.細胞的生長：將細菌接種在液態培養基中，置於其最適環境下(最適溫度、pH及氣體組成)培養，

7、則可求出一細菌生長曲線。細菌之生長曲線可分成以下數個時期：1.遲滯期(lagphase)：細胞正在適應新環境，數目無明顯增加。2.對數期(logphase)：細胞生長快速，數目呈幾何級數增加。3.靜止期(stationaryphase)：因養分耗盡、代謝廢物的堆積，細胞分裂與死亡速度相當，故其數目不增加。4.死滅期(deathphase)：細胞快速死亡，數目呈幾何級數下降。b.生長曲線之測量：可用pourplate法，直接求得活細胞數目，或是用分光光度計讀值法，間接推測細胞生長量。之後在半對數方格紙上作圖。c.generationtime的計算

8、：1.較粗略的計算(分光光度計結果)：GT＝t(O.D.2n)－t(O.D.n)GT：generationtime2.直接細胞數目的計算(pour-p