第四节-单链丝状噬菌体载体.doc

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1、第四节单链丝状噬菌体载体一、M13噬菌体的生物学1．M13噬菌体的组成和结构M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的基因组为单链DNA，由6407的碱基组成（GenBank注册号为V00604）。基因组90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因Ⅷ和基因Ⅲ以及基因Ⅱ和基因Ⅳ之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。M13噬菌体基因组可编码3类蛋白质，包括复制蛋白（基

2、因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组DNA为正链，按基因Ⅱ至基因Ⅳ方向合成，与噬菌体的mRNA序列同义。图3-20是M13噬菌体的遗传图谱。M13噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长880nm，直径6-7nm。噬菌体颗粒的核心由2700个基因Ⅷ编码的结构蛋白呈管状排列而成（图5-32），成熟的基因Ⅷ的产物为由50个氨基酸残基组成的α螺旋蛋白。顶端由5个基因Ⅶ和5个基因Ⅸ产物组成，作用于间隔区中的包装信号。5个基因Ⅲ蛋白和5个基因Ⅵ

3、蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。图3-21是M13噬菌体结构模型。2．M13噬菌体的增殖吸附是噬菌体感染的第一步，M13噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带F质粒的菌株可产生性纤毛。在吸附过程中，噬菌体的基因Ⅲ蛋白与性纤毛发生作用。随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因Ⅲ蛋白与宿主的TolQ、TolR和TolA蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒DNA及附着于其上的基因Ⅲ蛋白进入宿主菌体内。在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体DNA（正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链DNA，用于DNA的复制，因此这种双链DNA称为复制型DNA（r

4、eplicativeformDNA），即RFDNA。通过θ复制方式，RFDNA进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。M13噬菌体在感染细胞中的复制见图3-22。当基因Ⅱ蛋白在亲代RFDNA的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ的作用下，以负链为模板在切口的3'末端加入核苷酸，并持续DNA的合成，用新合成的DNA替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周

5、时，被取代的正链由基因Ⅱ产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组DNA。在感染开始的15～20分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成RFDNA，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链DNA。当感染细胞内累计有100-200个RFDNA时，细胞内也产生了足够的单链DNA结合蛋白，即基因Ⅴ蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因ⅡmRNA的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链DNA上，阻止其转化成RFDNA。此时，DNA的合成几乎只产生子代正链DNA。另外，基因Ⅹ蛋白和基因Ⅴ蛋白也是噬菌体特异DNA合成的强力抑制

6、子，从而限制感染细胞内RFDNA的数量。结果，感染细胞内RFDNA的数目和子代正链DNA的产生速率都能保持适度。成熟噬菌体颗粒由11个病毒蛋白中的5个组成，至少4个其他蛋白（如基因Ⅰ、Ⅳ和Ⅺ蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白（thioredoxin）对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。二、M13噬菌体载体单链DNA的酶切和连接是比较困难的，因此M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RFDNA。RFDNA很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。1．载体的插入位点在M13噬菌体基因组中绝大多数为必

7、需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之间）。基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的508bp间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因Ⅷ和基因Ⅲ之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因Ⅹ也可用来克隆外源片段。2．M13噬菌体载体组成现在所使用的M13噬菌体载体是Messing及其同事建立的mp系列载体，以基因Ⅱ和基因Ⅳ之间的区域作为外源DNA插入区。mp载体系列都是从同一个重组M13噬菌体（M13mpl）改造而来的。在M13mpl载体

8、中，间隔区内的HaeⅢ位点插入了一小段大肠杆菌DNA，引入α互补筛选。3．M13mpl8和M13mpl9M13mpl8和M13mpl9这两个载体含有13个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段（图3-23）。M13mpl8和M13mp