啤酒酵母选育.doc

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1、啤酒酵母选育项目紫外诱变及其突变株的性能测试1材料与方法1.1材料菌种：四铃啤酒酵母仪器：分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。培养基：麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）1.2试验方法1.2.1酵母菌的活化取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养14h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28℃恒温培养14h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定1.2.2.1菌悬液的制备取1OmL菌液离心收

2、集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。（此图视为参考）1.2.3紫外线诱变试验用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。(此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法)备注：平板直接计

3、数法：如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。2：显微镜直接计数法：比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。3：光电比浊法：虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。实验步骤：打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。1取斜面菌苔一环于2Om

4、L麦汁中混匀，28℃活化培养14h。2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整细胞浓度。3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数法，作为对照。4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上。530W紫外灯下30cm处照射，调整照射时间。本次预设为0，30，45，

5、60，90，120，180，600.（单位s）6取一定稀释梯度的紫外照射菌液0.1（视具体情况而定）用无菌涂布棒涂布均匀，每组做三个平行线培养记录菌落数，计算各照射时间下的致死率。（选在75%-80%）。致死率=未经照射菌落数-紫外照射菌落数未经紫外照射菌落数7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复1-5，再重复第5步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，连续进行5次，28℃培养20h左右，计算其突变率和致死率。（上述时间等数字视为参考数值）1.2.3.1初筛诱变后挑选在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面

6、光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。1.2.3.2复筛供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。双乙酰含量测定：初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml120Bx麦芽汁发酵8d后，测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵，将双乙酰含量明显降低的4株菌分别编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3和FB-E4。结果见表1表1发酵液中双乙酰含量的比较菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4双乙酰含量(mg/L)0.12330.

7、07060.09260.07760.0870降低率(%)042.724.937.129.4（此处绘制表格样式视为参考）双乙酰代谢的控制：1.降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量措施：改良酵母菌种提高麦汁中α-氨基氮含量，可以抑制合成酶的活性2加速双乙酰的还原措施：提高酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）提高还原温度（封罐后高温还原）限制后期酵母的出芽率（封罐）国标中对于啤酒中双乙酰的量的要求二级啤酒：0.2mg/L一级啤酒：0.13mg/L方法：国标GB4927-2001检测培养条件：恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。原理：双乙酰的测定方法采用

8、比色法。邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方