PCR核酸荧光定量检测技术ppt课件.ppt

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1、核酸定量检测技术分子杂交定量分析技术(一)分支链DNA信号放大技术（bDNA)美国Chiron公司,分别以微反应板和琼脂糖珠为载体，在定量检测系统中，采用了一种人工合成的、结构如同树枝的DNA信号放大探针，分支链DNA（branchedDNA）因此而得名。（二）双抗体夹心杂交法英国MurexDiagnosticsLtd发明,称之为Digene系统。该技术采用两种抗DNA/RNA杂交体的抗体：一抗为捕获抗体，直接吸附在微孔反应板上，二抗是偶联了AP的标记抗体，通过酶促化学发光反应检测DNA/RNA杂交体的信号。真正的核酸探针是RNA，它能特异地与HBVDNA基因组负链互补。PC

2、R基因定量技术PCR扩增循环过程（一）PCR基因定量基础Yn=Yn-1*(1+Ev)0<=Ev=>1Yn=X*(1+Ev)nLgY=LgX+n×Lg(1+E)LgX=LgY-n×Lg(1+E)决定扩增效率（E)的因素：反应体系方面：反应最佳条件、反应物的相对含量、循环次数反应管之间：扩增仪上不同位置标本之间：不同标本中所含有的DNA聚合酶的抑制剂引物和模板的结合能力模板的含量怎么办？摸索最佳的实验条件严格实验室规范化管理制定规范化的操作规程采用内标法（二）定量PCR的方法学分类:外标法非竞争内标定量PCR内标法竞争定量PCR构建内标物应具备:与靶基因待分析序列比较:相同

3、的引物结合位点相同的长度相似的碱基排列顺序或G+C%含量相似不同的探针结合位点内标法准确定量的原理：YSn=XS*(1+ES)nYIn=XI*(1+EI)nYSnXSYInXI内标物的构建:靶基因扩增产物的突变限制性片段的插入或缺失含靶基因引物结合位点的非同源性DNA序列（三）PCR产物的检测与定量终点检测法琼脂电泳扫描检测法固相捕获法非探针杂交捕获法探针杂交捕获法HPLC检测法实时检测法Taqman技术LightCycler技术ELISA-PCR技术一.荧光染料Fam(495nm)Tamra(560nm)L640Tet(520nm)Hex(537nm)L705Tamra/F

4、amTamra/TetTamra/Hex光能热能转移给临近的分子荧光定量PCR技术荧光共振能量转移(FRET)荧光标记信号的产生荧光标记探针动态监测荧光信号变化二.荧光PCR类型特异性荧光探针Taqman双荧光标记探针molecularBeacon荧光标记探针荧光标记杂交双探针特异性荧光双标记探针Taq酶5’→3’外切酶活性Molecularbeacon荧光标记杂交双探针变性退火延伸结束三.荧光实时定量PCR的定量原理：Y=X×(1+E)nLgY=LgX+n×Lg(1+E)LgX=LgY-n×Lg(1+E)n=LgY/Lg(1+E)–1/Lg(1+E)×LgX荧光实时PCR的

5、定量概念标准曲线未知标本CrossingPoint(Cycles)log(copynumber)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target在对数期进行定量分析的优势扩增效率恒定动态分析，变化灵敏标准曲线呈线性核酸定量检测临床应用免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。疾病的早期诊断任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价其疗效均

6、不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗效，则较为直接和理想。新药验证遗传疾病的早期诊断荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入突变、多基因突变等的检测，对产前诊断具有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优育，提高人口素质。荧光PCR可对病原体的母婴传播进行有效的监控，为确定宫内感染、围产期感染或哺乳期感染等提供依据，为母婴传播的阻断等提供参考。母婴传播的监控可对原癌基因的突变和易位等作出检测；可对原癌基因的mRNA进行定量分析；有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断；探索癌变发生机理的研究提供参考；区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。肿瘤的诊

7、断