双向电泳的技术流程和样品制备ppt课件.ppt

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1、双向电泳的技术流程和样品制备1994年，MarcWilkins首次提出了蛋白质组的概念蛋白质组指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTEin)蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律蛋白质组和蛋白质组学寻找差异蛋白质环孢素A处理前环孢素A处理后肿瘤组织细胞组织正常组织蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE技术依然是大

2、多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定双向电泳的概念•双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物

3、样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，已得到广泛应用。这项技术利用蛋白质的两种特性，分两步将不同的蛋白质分离双向电泳原理第一向:IEF变性的等电聚焦电泳根据蛋白质的等电点分离第二向:SDS-PAGESDS聚丙烯酰胺电泳根据蛋白质的分子量分离一块双向电泳胶上可以分离几千个蛋白点等电聚焦电泳（IEF）原理在电场存在下的一定pH溶液中，带正电的蛋白分子将向负极移动而带负电的蛋白分子将向正极移动，在某一pH时，蛋白分子在电场中不再移动，此时的pH值即为该蛋白质的等电点。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)原理在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量

4、的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，SDS：蛋白=1.4：1?断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。?作为强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。?改变蛋白质分子单体构象，使之全部变成似雪茄烟形的长椭圆棒型。双向电泳的优越性?对未处理样本耐受性好—不需要预纯化（如：色谱层析）?分辨率非常高?2D是有效的组分收集器?蛋白在凝胶介质中受到保护?在蛋白质组学技术中应用泛围最广?与其他技术相比，在一次试验中可检测到的蛋白点更多?与后续分析技术兼容性好双向电泳的实验步骤样本制备正确的样本制备对于良

5、好的双向电泳结果是绝对重要的。2.ImmobilineDryStrip干胶条水化进行IEF之前，必须加入恰当的添加物，使ImmobilineDryStrip干胶条溶胀。3.等电聚焦电泳（IEF）第一向IEF电泳在平板电泳系统中进行，电泳时采用超高电压和主动温度控制。4.ImmobilineDryStrip干胶条平衡将样本胶条在含有SDS的平衡液中进行平衡处理，以便第二向分离。5.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）样本胶条进行第二向SDS-PAGE凝胶电泳。6.显影对第二向凝胶基质上的蛋白质斑点进行染色，使之显影。如果蛋白质经

6、预先标记过，就可以通过放射自显影、或紫外线照射、或荧光显像的方法使蛋白质斑点显影。7.分析对样本双向电泳斑点结果进行分析。双向电泳分析中的样品制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。可溶性样品固体组织样品细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择

7、性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。样品液的准备标准液：ReagentAmount

8、8Murea47mlof8.5stockor24gureain25mlH2O50mMDTTor2mMTBP385mgor500ulof200mMTBP