免疫细胞的分离与检测ppt课件.ppt

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1、第一节免疫细胞的分类与分离一、免疫细胞的种类与特征二、免疫细胞的分离技术三、细胞的冻存与复苏一、免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性2、免疫细胞的膜分子特征CD分子NKcells吞噬溶酶体二、免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法2、黏附分离法3、荧光激活分离法4、磁性分离法5、其他分离法1、密度梯度离心法聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重

2、小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细胞2、黏附分离法-纯淋巴细胞群的分离贴壁法：将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。2、黏附分离法：淋巴细胞亚群的分离尼龙毛法：混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核

3、细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。T细胞得率为20-30%左右。亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。3、荧光激活分离法（FACS）流式细胞仪4、磁性分离法（1）磁

4、铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。（2）磁激活细胞分离术MACs：是一种特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场—MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标

5、记的细胞组分。MACS(阳性选择法）NSMACS(阴性选择法）NS5、其他分离法花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达到可直接特异性检测t细胞的目的。作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。用于过继性肿瘤免疫治疗用于疫苗疗效的监测抗

6、原肽-MHC分子四聚体技术TMHCI类(左)和Ⅱ类(右)分子四聚体结构示意图三、细胞的冻存与复苏1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。2、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。细胞冻存罐第二节免疫细胞膜分子的检测一、免疫细胞膜分子

7、检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法一、免疫细胞膜分子检测的原理与类型1、以抗体识别抗原2、以配体识别受体二、免疫细胞膜分子的主要检测方法1、免疫标记检测方法荧光抗体法酶免疫检测法免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）3、花环形成试验SmIg的荧光抗体检测法SmIg的酶免疫检测法补体依赖的细胞毒试验（CDC）染料补体E-花环：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体T细胞B细胞花环形成细胞绵羊红细胞EA-花环