第三章沉淀技术ppt课件.ppt

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1、沉淀技术第三章沉淀技术第一节蛋白质沉淀的基本原理第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用第一节蛋白质沉淀的基本原理一、蛋白质的溶解性蛋白质是由许多氨基酸缩水形成的一条或几条多肽链所组成的两性高分子聚合物，溶解性是由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。因此，蛋白质表面大部分是亲水的，而其内部大部分是疏水的(见图4-1)，亲水和疏水区域的分布和程度将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度。在生理pH

2、值条件下，如果这些可离子化的基团和水分子在蛋白质表面同时存在，则离子化基团至少能部分带电并被溶剂化。分子量的大小对蛋白质的溶解度也会有影响，通常情况下分子量小的蛋白质比起在结构上类似的大分子量蛋白质更易溶解。第一节蛋白质沉淀的基本原理另外，蛋白质的溶解度同样也取决于所处环境的物理化学性质。影响蛋白质溶解度的外部因素主要有温度、pH、介电常数和离子强度。但是在同一特定的外部条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度，这是因为溶解度归根结底取决于溶质本身的分子结构。如分子所带电荷的性质和数量、亲水与疏水基

3、团的比例及两种基团在蛋白质分子表面的排列等。第一节蛋白质沉淀的基本原理二、蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质溶液是一种分散系统。蛋白质分子是分散相，水是分散介质。就其分散程度来说，蛋白质溶液属于胶体系统，但是它的分散相质点是分子，它是蛋白质分子与溶剂（水）所构成的均相系统，分散程度以分散相质点的半径来衡量。根据分散程度可以把分散系统分为3类：分散相质点小于1nm的为真溶液，大于100nm的为悬浊液，介于1nm～100nm的为胶体溶液。从蛋白质相对分子量的测定和形状的观测知道，其分子的大小已达到胶体质点

4、1nm～100nm范围之内，具有胶体性质，如布朗运动、丁达尔现象、电泳现象、粘度大以及不能透过半透膜的性质等。第一节蛋白质沉淀的基本原理球状蛋白质的表面多亲水基团，具有强烈地吸引水分子作用，使蛋白质分子表面常为多层水分子所包围。实验证明，每一克蛋白质约可以结合0.3g～0.5g的水，使蛋白质分子表面形成一层水膜，称水化膜。蛋白质分子表面具有许多可解离的基团，因此在一定的pH条件下，能与其周围电性相反的离子形成所谓双电层。由于水化层和双电层这两种稳定的因素，使蛋白质溶液成为亲水的胶体溶液。由于水化

5、膜和双电子层的存在，蛋白质颗粒彼此不能接近，因而增加了蛋白质溶液的稳定性，阻碍蛋白质胶粒从溶液中沉淀出来。第一节蛋白质沉淀的基本原理三、沉淀动力学溶解度是一个平衡特性，但是溶解度值降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚集作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起：①热运动（布朗运动）；②对流运动，由机械搅拌产生；③差速沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。其中①和②两种机理在蛋白质沉淀中起主导作用，第3种机理在沉降过程中起主导作用（如在废水处理中）。由布朗运动所造成的碰撞导

6、致异向聚集，而由对流运动所造成的碰撞导致同向聚集。第一节蛋白质沉淀的基本原理沉淀剂的性质和浓度，加入蛋白质溶液的方式，反应器的几何形状和水力学特性都会影响沉淀过程的动力学和聚集体的数量与大小。沉淀剂的加入可快可慢，可以溶液形式也可以固体形式加入（如硫酸铵）。在搅拌式反应器或管式反应器或活塞式流动反应器中，它们的混合情况各不相同，因此沉淀剂和蛋白质溶液之间的接触状况在这些反应器中很不相同，得到的絮体或聚集体的性质也不相同。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用一、基本方法蛋白质的沉淀有可逆和不

7、可逆沉淀两种。蛋白质发生沉淀后，若用透析等方法除去使蛋白质沉淀的因素后，可使蛋白质恢复原来的溶解状态，这就是蛋白质的可逆沉淀。重金属盐类、有机溶剂、生物碱试剂等也可使蛋白质发生沉淀，但不能用透析等方法除去沉淀剂而使蛋白质重新溶解于原来的溶剂中，这种沉淀作用称为不可逆的沉淀。生化分离纯化中最常用的几种蛋白质的沉淀方法是：盐析法（中性盐沉淀）、有机溶剂沉淀、选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）、等电点沉淀、有机聚合物沉淀、金属离子沉淀法。第二节蛋白质沉淀的基本方法及沉淀技术的应用1．盐析法（中性盐

8、沉淀）盐析法中常用的中性盐有(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4等。中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，称为“盐溶”；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称“盐析”。盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，可恢复蛋白质的活性。除蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清液中。盐析法