抗菌活性测试步骤.docx

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1、抗菌活性测试步骤及实验器材第一天中午12点1、准备9个锥形瓶（1个备用，4个培养菌液，4个稀释菌液），洗净，烘干2、先在备用锥形瓶中配制500ML液体培养基，溶解后，倒入其余8个锥形瓶中，每瓶50ML。盖上半透膜，用绳或皮筋系住，在用报纸盖上一层，用皮筋系住。液态培养基：蛋白胨5g，酵母2.5g，氯化钠5g，水500ML，按比例增减。（半透膜）第一天下午3点3、将9个锥形瓶，200μL枪头两盒，10μL枪头，1ML枪头，用报纸包住，放入灭菌箱中，灭菌20min。121摄氏度。（灭菌锅）第一天下午4点4、配药液，按照0.0010g—1M

2、L，0.0020g—2ML，这种浓度配药液配出的浓度为1000μg/mL,溶剂为DMSO：水=1:1.等着全部溶解。第一天晚上6点5.稀释药液，将配制好的药液浓度为1000，500，250，125μg/mL，四个浓度梯度。第一天晚上9点6、将超净台打开紫外灯灭菌20min，点燃酒精灯，从灭菌箱取出4个锥形瓶，把接种环放在酒精灯上烧红，冷却几秒，从固体斜面菌落中划出一点，放在培养基中，放入摇床（转速131，温度37摄氏度）中培养12个小时。（从左到右依次为接种环，超净台，摇床）第二天早上7点7、将超净台打开紫外灯灭菌20min（需要灭菌

3、的器材：96孔板，枪，酒精灯；放在超净台上即可）。将稀释好的药液加入到96孔板中，每孔加10μL（用从灭菌器中取出灭过菌的10μL枪头），横行12个孔，每种浓度的药液重复加3个孔；竖行8排，8种药。每种菌要加一排阳性对照：即氯霉素4种浓度，每种浓度重复3个孔，4个浓度，正好横行一排12个孔。再加一排对照，其中3个孔为溶剂10μL（无药空白对照），另三个孔只加菌液90μL（阴性对照）（96孔板，EP管）第二天早上9点——到11点8、把摇床中菌液取出（浑浊即为菌长起来了），再把灭菌器中的另外4瓶培养基和1ml的枪头取出，点燃酒精灯，用酒精

4、喷壶，喷下试验台和手，进行灭菌。从摇床取出的菌液中，吸取1ml，放在1瓶培养基中，稀释50倍（50—100倍均可，看菌的浓度），[如果菌液长的很浓，则20ML培养基中加一滴菌液（用200ul的吸头,一滴约10微升]，再取出200μL的枪头，将稀释好的菌液，加到96孔板中，每孔90μL，加完放在培养箱内培养24小时。（阴性对照孔只有90μL菌液，未添加任何药液或溶剂）第三天早上7点9、配制MTT（现用现配，因为较难溶，一般提前1夜配制，避光称量，避光配制）：溶质：MTT溶剂：PBS缓冲液，磷酸二氢钾0.24g，磷酸二氢钠1.44g，氯化

5、钠8.0g,氯化钾0.2g，1L蒸馏水（按比例增减）用PBS配制4mg/ml的MTT，每孔加10μL第三天早上11点10、加完MTT，放在37度恒温箱中，培养4个小时。（恒温箱）第三天下午三点11、3小时后，取出，大概称量下96孔板的重量（使他们放在离心机中可以平衡，相对的板质量差不可以超过0.02克）放在离心机中离心3分钟，3050RPM3MIN,离心结束后，甩掉上层清液（），用排枪在96孔板中每孔加入150μLDMSO（二甲基亚砜），轻摇5-30min溶解，放在酶标仪中测量，得到数据。（从左到右依次为排枪，离心机，酶标仪）仪器：锥

6、形瓶,半透膜,200μL枪头两盒，10μL枪头，1ML枪头,灭菌箱,,EP管,超净台,接种环,酒精灯，摇床，96孔板，枪，恒温箱，离心机，酶标仪。药品：蛋白胨,酵母，氯化钠,DMSO，MTT，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠,氯化钾，得到数据之后，整理数据，每三组平行数据求出平均值（偏差太大的数据删除），，打开SPSS软件，第一列填入浓度，第二列填入空白对照（加10微升溶剂的）OD值，第三列填入【空白对照（加10微升溶剂的）OD值-加入药品的OD值】，得到一组数据，点Analyze中的Regression中的Probit,按照这个将三列数剧拖进

7、去，将Transform选中Logbase10。OK后生成一个文件，在文件中找到IC50和IC80（MIC）（或者第一列填入浓度，第二列填入1，第三列填入抑制率【空白对照（加10微升溶剂的）OD值-加入药品的OD值】/空白对照（加10微升溶剂的）OD值，得到一组数据，）