电泳技术-昆明医科大学电子教案.ppt

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1、电泳技术-昆明医科大学COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH4.0时，带净的负电荷。2、带电颗粒在电场作用下所受的力：(Chargedparticlesundertheactionof

2、electricfieldforce)电场力F=qE阻力Ff=fνq—带电颗粒所带的有效电荷；E—电场强度；ν—带电颗粒在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数F=FfqE=fν对于一个球形带电颗粒，服从Stoke定律，即：f=6πrηr为带电颗粒的表观液态动力学半径，η为介质粘滞系数。当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动:(Whenelectrophoresisbalance,electricallychargedparticlesinuniformmotion)∴ν=qE／6πrην=qE／f带电颗粒在电场中的差速迁移是电泳分离的基础。

3、3.影响电泳速度的因素：(Theinfluencingfactorsofelectrophoresisrate)样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：缓冲液：成分，pH，离子强度支持介质的筛孔大小：支持介质：电渗作用，吸附作用电渗ν=qE／f=qE／6πrη三、电泳装置Electrophoresisapparatus电源(powersupply)水平式电泳槽(Horizontalelectrophoresistank)垂直式电泳槽(Verticalelectrophoresistank)按支持介质种类不同分为：惰性介质(Inert

4、medium)：起支持作用，减少对流，介质本身不参与电泳分离纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、硅胶电泳、氢氧化铝电泳凝胶介质(Thegelmedium)：起支持作用，减少对流，介质本身参与电泳分离琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳2.按支持介质形状不同分为:薄层电泳、板电泳、柱电泳四、电泳的分类(Theclassificationofelectrophoresis)3.按电泳槽方向不同分为：水平电泳、垂直电泳4.按用途不同分为：分析电泳、制备电泳5.按所用电压不同分为：低压电泳（100V～500V）、高压电泳（1000V～500

5、0V）6.按分离原理不同分为：移动界面电泳（自由界面电泳）、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳7.按样品是否经过还原剂处理分为：还原电泳、非还原电泳8.按凝胶介质中是否加入变性剂分为：变性电泳、非变性电泳9.按电泳系统的均一性分为：连续电泳、不连续电泳10.按样品被分离时凝胶介质的pH不同分为：酸性电泳（pH=4.3）、碱性电泳（pH=8.8）琼脂糖凝胶电泳(AgarosegelelectrophorsisofDNA)一、琼脂糖凝胶电泳的特点(Thecharacteristicsoftheagarosegelelectroph

6、oresis)琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。将琼脂糖悬浮于缓冲液，加热溶解，冷却后即成琼脂糖凝胶。该凝胶具有刚性的凝胶孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，所带净电荷的多少不同,电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。分子筛效应（Molecularsieveeffect）：分子量或分子大小和形状不同的带电颗粒通过一定孔径的凝胶时，因受阻

7、滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应（Chargeeffect）：带电颗粒由于所带电荷量不同，而在电泳中表现出不同的迁移率，这就是电荷效应。EB显带（EBbanding）电泳后EB染色EB加入凝胶中电泳经EB染色后，电泳结果在波长为254nm的紫外灯下观察。[注意]在分子量相当的情况下，DNA的电泳迁移率依次为：超螺旋环状DNA>线状DNA>缺口环状DNA琼脂糖凝胶电泳由于其所分级分离的生物大分子比聚丙烯酰胺凝胶电泳大，因此适合于分离核酸（DNA和RNA）和蛋

8、白。三、电泳的应用(Applicationofelectrophoresis)聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegelelectrophorsis,PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交