限制性内切酶.ppt

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1、限制性核酸内切酶概念限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。类似于DNA测序中的化学修饰法第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写第4个字母代表株最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。HindⅢ属系株序Haemophilusinfluen

2、zaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶限制性内切酶的类型根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅助因子，可将目前已鉴定出的限制性内切酶一般将限制酶分为3种不同类型。I型：切割位点不确定，不适用于基因工程。Ⅱ型：基因工程的工具酶。Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作亦无实用意义。首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离得到。I型限制性内切酶作用原理：识别双链DNA未甲基化修饰的特异序列，与该序列相互作用，然后延DNA分子移动，在距离特异性识别位点约10

3、00-1500bp处随机切开一条单链，造成大约75个核苷酸的切口。首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌Rd菌株中分离出来。作用原理：识别双链DNA上未甲基化修饰的一小段明确的序列（多数是回文序列），然后在识别位点之内的特定位置切割。II型限制性内切酶一般性状对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用，识别序列通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在识别

4、序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。酶切切口齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端（不易重新连接）。粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTTpAACNNNNN3’3‘NNNNNCAApTTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶

5、切切口（平端）5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’PstI的识别序列和酶切切口（粘端）CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTC同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGC

6、TT-3’3’-TTCGAA-5’完全同裂酶不完全同裂酶XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤Y代表嘧啶。同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。同尾酶的粘性

7、末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’能完全肯定的识别位点和切割位点，但切割位点也是在识别位点的一侧的一定距离，通常距特异性位点24bp-26bp。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAGIII类限制性内切酶核

8、酸限制性内切酶不同类型比较特性I类内切酶II类内切酶III类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一