生物素-过氧化物酶讲课教案.ppt

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1、生物素-过氧化物酶第一节生物素－亲和素免疫细胞化学技术一、基本原理（一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素（Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力；（二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过氧化物酶等相结合的能力。二、几种经典的抗生物素－生物素染色法（一）ABC（AvidinBiotin-peroxidaseComplex）技术（二）LAB（LabelledAvidin-Biotin）技术（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotinmethod）：S-P（streptavidin－pero

2、xidase）技术SABC（streptavidin-biotincomplex）技术（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin）技术（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法（六）Envision技术（一）亲和素-生物素-过氧化物酶（AvidinBiotin-peroxidaseComplex，ABC）技术1．基本原理2、操作步骤（1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗；（2）用3%H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗；（3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15

3、min；（4）加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃1h；（5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃30min；（6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素和酶标生物素混合，稀释配制成ABC复合物),37℃20min；（7）PBS洗，经DAB/H2O2显色；（8）常规脱水，透明，中性树胶封固。3、ABC法的优点（1）敏感性高:结合力强,分子量小;（2）特异性强，背景染色淡；（3）方法简便，节约时间；（4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。（二）标记生物素-抗生物素技术（Labe

4、lledAvidin-BiotinTechnique,LAB技术）1、基本原理以生物素标记抗体作第一抗体，酶标记抗生物素作为第二抗体，同S-P技术LAB法示意图2、操作步骤（1）①-④步骤与ABC法相同；（5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃30min；（6）PBS洗后加酶标亲和素（如HRP-Avidin）37℃30min：（7）以下步骤同ABC法。（三）LSAB（labeledstreptavidinbiotin）技术：S-P（streptavidin－peroxidase）技术SABC（streptavidin-biotincomplex）技

5、术1、基本原理2、操作步骤（1）常规切片脱蜡至水；（2）必要时抗原修复：如高温高压修复；（3）3%H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min；（4）水洗，PBS洗，10%牛血清白蛋白20min；（5）加一抗4℃过夜或37℃孵育1h；（6）PBS洗，滴加生物素化的二抗37℃30min；（7）PBS洗，滴加HRP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素（SABC），37℃孵育20min；（8）DAB/H2Ｏ2显色，常规脱水、透明、中性树胶封固。（四）BRAB（BridgedAvidin-Biotin）技术1、原理以生物素标记抗体作第一抗体，抗

6、生物素作为第二抗体，桥接酶标生物素。2、操作步骤（1）①-③步骤与ABC法操作相同；（2）加一抗4℃过夜或37℃1h；（3）PBS洗后加生物素标记的第二抗体37℃30min；（4）PBS洗后加亲和素37℃孵育30min；（5）PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃30min；（6）PBS洗后用DAB/H2Ｏ2显色；（7）常规脱水、透明、中性树胶封固。（五）CSA（Catalyzedsignalamplification）法1、原理根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局

7、部），使原始信号得到几何级放大，敏感性更高，尤其适合原始信号较弱的信号检测，但操作较复杂。第一步　　　　第二步　　　　第三步　　第四步　　　　　　　　　　第五步2、操作步骤（1）常规脱蜡至水，必要时用抗原修复处理；（2）3%H2Ｏ2甲醇液15min；（3）正常封闭血清，室温20min，甩干；（4）滴加特异性一抗4℃过夜或37℃孵育1h；（5）PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃30min；（6）PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（7）PBS洗，滴加生物素化酪胺基团分子，37℃孵育20min；（8）PBS

8、洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育20min；（9）PBS洗后，DAB/H2